猪口腔液中伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸稳定性研究

郭振华，乔松林，邓瑞广，张改平,2,3*

(1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002；2.河南农业大学动物医学院，河南郑州 450002；3.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

哺乳动物口腔液(oral fluids，OF)是一种由唾液和黏膜渗出液组成的混合液体，包含多种电解质、蛋白、酶类、抗菌因子和糖蛋白等，同时也含有通过齿龈沟和毛细血管进入口腔的血清渗出液等[1]。在医学领域，口腔液已广泛用于疾病诊断和病原微生物、激素及药物等的检测[2]；在兽医领域，最早于1905年就有俄罗斯学者利用马口腔液开展疫病诊断的报道[3]。在养猪生产中，最早的报道见于1976年利用猪口腔液开展猪瘟抗体检测的研究[3]。2010年以来，随着对猪口腔液作为生物检材的系统研究，口腔液在猪群健康监测和疫病病原检测中才逐渐得到了广泛的应用[4-5]。猪口腔液作为抗体和病原检测的有效检材，与传统生物检材如血液和组织相比，具有明显的优势，包括采集极为方便、简易，对猪群无应激，少量样品就可以代表较大的动物群体，更为经济有效[6-7]。目前，猪口腔液已广泛用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)[8]、猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)[9]、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)[10]、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)[10]、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)[11]、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)[12]、猪沙门氏菌(SwineSalmonella)[13]、猪支原体(Mycoplasmasuis)[14]等重要病原的临床监测。

鉴于口腔液成分相对较为复杂，目前关于病毒核酸在口腔液中稳定性的相关报道较少。本研究利用PRV和PRRSV评估核酸保护剂和温度对口腔液中病毒核酸稳定性的影响，以期为口腔液样品的正确保存和运输提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 口腔液采集 猪口腔液采自河南鹤壁某规模化养殖场12周龄左右的猪群。具体方法如下：取直径1.6 cm、长度约1.2 m的纯棉绳一条，悬挂于栏位的一侧，绳子一端的高度在猪的肩部，以猪方便咬到为宜。让猪咬绳子约20 min～30 min左右，将绳子润湿的一端放入收集袋中，用力挤压，以≥2 mL为有效采样量，转移至15 mL离心管，低温运输至实验室。口腔液样品5 000 r/min离心3 min，除去大的颗粒物，取上清分装保存于-80℃备用。

1.1.4 主要仪器 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System进行荧光定量PCR检测，美国应用生物系统公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验方案见表1。核酸保护剂和口腔液按照1∶1体积比进行混合，然后分别加入5 × 103TCID50的PRV或者1 × 105TCID50的PRRSV培养液，同时设置PBS对照组，分别在4 ℃和室温条件下保存，在保存后的第1、2、3、4、7天分别收取200 μL样品，置-80 ℃冰箱备用。

表1 试验方案设计

表2 本研究所用引物信息

1.2.3 数据分析 所获得的数据利用GraphPad Prim 7进行分析处理，数据的统计学分析采用t检验。*表示P<0.05；**表示P<0.01。

2 结果

2.1 核酸保护剂对口腔液中病毒核酸稳定性的影响

含有PRRSV或PRV的口腔液，在4 ℃和室温条件下分别进行保存，在指定的时间点进行取样，然后利用荧光定量PCR技术评估各组样品中PRRSV或PRV的核酸拷贝数。如图1所示，核酸保护剂组(DNA/RNA shield)和PBS组相比，在4 ℃条件下保存1 d后，PRRSV核酸含量要比对照组高10倍～20倍(图1A)，PRV核酸含量则要高6倍～40倍(图1B)；而在室温条件下保存1 d后，PRRSV核酸含量要比对照组高40倍～60倍(图1C)，而PRV的核酸含量则要高100倍～200倍(图1D)。病毒核酸含量在PBS组和核酸保护剂组之间存在显著差异。结果表明，核酸保护剂可以有效保护口腔液中的病毒核酸不被降解。

A.PRRSV/4 ℃;B.PRV/4 ℃;C.PRRSV/室温;D.PRV/室温A.PRRSV/4 ℃;B.PRV/4 ℃;C.PRRSV/Room temperature;D.PRV/Room temperature

2.2 温度对口腔液中病毒核酸稳定性的影响

核酸保护剂(DNA/RNA shield)组(图2A和图2C)和PBS对照组(图2B和图2D)分别在保存1、2、3 d时采集样品，然后利用荧光定量PCR评估样品中PRRSV和PRV的核酸含量。结果如图2所示。当添加核酸保护剂时，样品在4 ℃或者在室温条件保存1 d～3 d，PRRSV和PRV的核酸含量都基本一致(图2A和图2C)，各组之间差异不显著；而在PBS对照组，样品在4℃和室温保存1d后，4 ℃条件下的PRRSV和PRV的核酸含量要比室温条件下高10倍左右(图2B和图2D)。结果表明低温条件可以有效延缓病毒核酸的降解，当加入核酸保护剂时，基本可以克服温度对样品保存过程中核酸稳定性的影响。

A.PRRSV/核酸保护剂;B.PRRSV/PBS;C.PRV/核酸保护剂;D.PRV/PBSA.PRRSV/Nucleic acids shield;B.PRRSV/PBS;C.PRV/Nucleic acids shield;D.PRV/PBS

2.3 核酸保护剂对不同核酸提取试剂盒提取核酸效率的影响

核酸保护剂是一种强的蛋白质变性剂，为进一步评估核酸保护剂的使用是否能够兼容不同公司的核酸提取试剂盒。本研究针对同一份样品，分别用配套的核酸提取产品(ZYMO RESEARCH)和TaKaRa公司的核酸提取产品，进行病毒核酸的提取，然后利用荧光定量PCR分别评估PRRSV和PRV的核酸含量。结果如图3所示，当使用TaKaRa公司(T company)的核酸提取产品时，与核酸保护剂自带的核酸提取产品(Z company)相比，PRRSV和PRV的核酸得率基本一致，二者之间无显著差异。

A.PRRSV;B.PRV

3 讨论

传统意义上猪病的临床诊断和猪群健康监测，主要以猪的血液和组织作为临床检测材料，采集过程中对猪的应激较大，且耗时费力，当检测样本量大时又面临高昂的费用成本，且样品采集有一定的技术要求。针对以上问题，体液检测或者猪的排泄物、分泌物等越来越被兽医技术人员和养殖生产者所青睐。其中猪口腔液具有采样简便易行、对动物无应激、更为经济高效等优点，越来越多的被作为临床疫病诊断和猪群健康监测的材料使用[6-7,17]。Klaas D等报道了利用口腔液开展猪瘟病毒早期检测的研究[18]；Alejandro R等利用猪口腔液对10个猪场开展了PCV2、PRRSV和SIV等病毒感染情况的监测，结果显示PCV2的检出率为85%，PRRSV的检出率约为12%，而SIV的检出率约为8%[3]；Yaowalak P等比较了PRV感染后猪口腔液和血清中PRV核酸的检出情况，结果发现在感染后3 d～21 d，口腔液样品的检出率为20%～100%，而血清样品中未检测到病毒核酸[11]。Marisa等以PRRSV为例，系统介绍了利用口腔液开展动物疫病监测时的采样方案及注意事项[19]。此外，也有多篇研究报道了利用口腔液开展猪丹毒丝菌、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，PM)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)和猪链球菌(Streptococcussuis，SS)等细菌的检测[5]。

我国自2018年非洲猪瘟暴发以来，猪口腔液是临床开展疫病监测和非洲猪瘟定点清除时使用的最为广泛的一种生物检材[12,20]。口腔液样品的保存和运输，很大程度上影响了后续检测环节的成败[17]。同时，口腔液成分相对较为复杂，包括黏液素、淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶、富脯氨酸糖蛋白以及血清渗出液等[1-2]，目前病原微生物核酸在口腔液中稳定性的研究还相对较少。柴伟东等[21]以PRRSV和PRV的核酸为例，报道了样品保存液在猪口腔液检测中的应用，评估了不同样品保护液对病毒核酸的保护作用。本研究旨在评估核酸保护剂以及口腔液样品保存运输的温度对PRRSV和PRV核酸稳定性的影响，结果显示，当使用核酸保护剂时，口腔液样品保存1 d后，PRRSV和PRV的核酸含量在低温条件下(4 ℃)会比PBS对照组高10倍左右，而在室温条件下，PRRSV和PRV的核酸含量则要高100倍左右；当不使用核酸保护剂时，口腔液样品在4 ℃与室温条件下保存1 d后，4 ℃保存条件下，PRRSV和PRV的核酸含量仍比室温条件下高10倍左右。而在核酸保护剂存在的条件下，PRRSV和PRV的核酸在室温与4 ℃条件下保存1 d～3 d，核酸含量基本保持一致，不受外在保存温度的影响。本研究还进一步评估了核酸保护剂对不同核酸提取产品提取核酸效率的影响。结果显示核酸保护剂可以兼容不同的核酸提取产品。此外，核酸保护剂作为一种强的蛋白质变性剂，可以杀灭细菌、病毒和真菌等多种微生物，因此，经过核酸保护剂处理的样品，在最大限度保持所含核酸物质稳定性的基础上，还有助于避免在样品运输及后续的处理过程中带来的二次污染问题，具有重要的生物安全意义。

核酸保护剂的使用和低温运输对于维持口腔液中核酸稳定性具有重要的作用，为口腔液作为生物检材的科学使用提供了有价值的信息。