阿尔茨海默病动物模型研究进展

贾亚泉,宋军营,曾华辉,谢治深,张紫娟,王铷,袁野,张振强

(河南中医药大学中医药科学院,郑州 450046)

AD的主要病理特征在于认知功能的进行性恶化,这可能与AD患者的脑容量显著减少有关[1],脑萎缩是由神经元的死亡和突触的退化引起的,大脑特别是海马中在认知记忆和空间定位中起主要作用[2-4]。在AD疾病机制研究中主要通过动物模型来实现,现有的AD动物模型有自然衰老动物模型、转人类基因动物模型、物理法构建痴呆动物模型、化学法构建动物模型,以及两种或两种以上方法共同构建等,但每种方法都有其优缺点,均不能完美的与临床病理特征相符合。因此,在AD疾病机制研究和防治药物筛选中选择合适的实验动物模型起到关键性作用。

1 衰老动物模型

人类衰老机制研究和抗衰老药物筛选的重要手段是选择合适的衰老动物模型。应用衰老动物模型对AD进行实验研究具有一定的代表意义。在实验研究中应用的衰老动物模型主要有自然衰老动物模型和快速老化动物模型。

1.1 自然衰老模型

自然衰老动物模型是通过对1～2月龄的大小鼠日常维持饲养到小鼠18～24月龄、大鼠24月龄基本相当于人类56～70岁[5]来构建衰老动物模型。自然衰老动物模型建模简单,在衰老期时出现脑内神经元变性、胆碱能功能降低、感觉、行为和记忆障碍等与临床患者相似的各种病理特征[6-7]。因此,在AD研究中自然衰老动物模型作为首选动物模型。但自然衰老模型的缺点是建模时间较久,一般情况下要饲养15个月以上(现在虽然可以直接购买到适龄动物,但每只动物的价格高的惊人),由于在建模过程中饲养时间过长,投入的人力和物力成本相对较大,另外,在饲养过程中感染其他疾病机率也相对较高且健康状态较差,特别是进入老龄期后容易死亡,在后期样本检测中个体差异大。

1.2 快速老化模型

日本京都大学竹田俊男教授在1968年培育出快速老化小鼠(SAM),在此基础上又于1975年培育出易快速老化系小鼠(SAMP)和抗快速老化系小鼠(SAMR)。根据生理病理表现SAMP分为P1-3和P6-11,SAMR分为R1、R4和R5。其中SAMP8小鼠在学习记忆减退、神经递质改变、APP代谢异常、Aβ沉积等方面表现出与年龄相关的AD临床特征,一致认为是研究AD最好的动物模型。SAMP8小鼠的一般生存时间为10～12个月,在6个月龄之后进入老化加速期[8]。在月龄相同情况下,SAMR1小鼠表现出抗痴呆特征,在实验研究中一般作为SAMP8鼠的对照[9]。快速老化小鼠具有饲养周期短,衰老特征明显的优点,但快速老化小鼠相比其他模型小鼠价格较贵,且SAM动物繁殖能力较弱,相对来源较少,具有一定的局限性。

2 转基因动物模型

由于转基因动物发病原因确定,病理症状已知,有利于AD机制研究和防治药物的筛选。一般以与AD发病有关的APP、早老素(PS)和ApoE等基因突变为主的单转基因、双转基因和多转基因动物模型为主要研究对象。

2.1 APP转基因动物模型

神经细胞β-淀粉样前体蛋白(APP)转基因动物模型是将人源性APP基因与小鼠基因组整合、表达和遗传。与正常动物相比,APP转基因动物脑中Aβ表达过量,引起认知功能障碍等系列AD临床病理特征。

2.1.1 PDAPP小鼠模型

转人类APP695swe和APP717 V-F基因的PDAPP小鼠模型是由C57BL/6鼠与DBA/2F1鼠杂合而生。PDAPP小鼠APP表达水平高,6～9月龄时在模型小鼠大脑多区域表现出与AD相似的病理表现,如细胞外Aβ异常沉积、突触丢失、神经炎症反应和小胶质细胞增生等,但NFTs形成不明显。采用Aβ疫苗免疫转基因鼠,可以明显降低脑组织中淀粉样沉淀,从而改善记忆力的减退[10],由于PDAPP小鼠在同月龄脑中Aβ沉积异常,主要用于与Aβ相关的AD疾病机制研究[11]。

2.1.2 Tg2576小鼠模型

Tg2576小鼠模型是转人类APP695基因小鼠,在9～12个月时表现出学习记忆功能减退,在大脑多部位逐渐出现Aβ沉积和形成老年斑(SP),在皮层出现星形胶质细胞聚集[12-13];Bilkei[14]认为Tg2576小鼠的认知障碍与AD病人相比不明显,出现神经元丢失,但无NFTs形成。根据以上Tg2576小鼠的病理特点,该模型一般应用于早期AD的研究。

2.1.3 APP23小鼠模型

将人类APP695基因通过仓鼠由转人类APP695鼠和APPV717I鼠交配得到的APP23小鼠模型,主要特点是APP水平在脑内过度表达引起一系列的AD病理表现,在3月龄时呈现进行性加重的空间学习记忆障碍[15];在6月龄时出现Aβ沉积、神经炎性斑块、突触丢失、tau蛋白过度磷酸化及CAA等,但无SPs形成。在8～9个月龄时Aβ沉积加重,并有SPs形成[16]。APP23小鼠缓慢性形成SPs与AD患者病理发展较一致[17]。

2.1.4 TgCRND8小鼠模型

由转人类APP695鼠和APPV717F鼠交配得到的TgCRND8小鼠模型,在3月龄时出现Aβ沉积、认知功能障碍等AD病理表现,5月龄时伴有神经炎症反应,形成SPs,伴随胶质细胞增生出现,且随年龄增长而加重[18-19]。

2.2 tau转基因动物模型

tau转基因小鼠模型是根据神经元轴突中的tau蛋白基因突变引起的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)这一AD主要病理特征构建的。沈林林等[20]认为tau转基因小鼠由于自噬能力降低,使大脑中异常tau蛋白磷酸化水平累积,p62蛋白表达水平降低,引起神经细胞凋亡或坏死,最终导致认知功能障碍。该转基因模型动物的主要特性是认知功能障碍和NFT形成,但Aβ沉积不明显[21]。

2.3 APP/PS-1双转基因模型

利用基因打靶技术培育出的APP/PS-1双转基因鼠,在3月龄时出现学习记忆障碍、Aβ增多和形成SP,6月龄时即可出现严重的学习记忆力衰退、认知功能障碍,神经元变性和突触丢失等多种AD病理特性[11,22-24]。对AD病理特征中Aβ和SP方面的研究主要采用APP/PS-1双转基因鼠。但其外源性基因表达不够稳定、动物价格高。

2.4 APP/PS1/Tau三转基因模型

APP/PS1/Tau三转基因小鼠模型是由APPSwe、PS1、TauP301L基因系突变建立的[25],首先在皮质区出现Aβ异常沉积、SP和NFTs形成,随后,海马区也逐渐出现Aβ沉积、SP和NFTs,以及突触丢失、神经元变性[26]等一系列AD临床病理表现。APP/PS1/Tau三转基因小鼠模型是目前与AD病理特征最为接近的转基因动物模型,但其外源性基因表达稳定性较差、造模较困难且造价高。

3 物理损伤动物模型

动物脑血流量老年期较成年期减少20%以上,脑部慢性缺血、缺氧使脑的正常功能受损,出现认知功能障碍等AD病理性改变[27]。由此理论在实验研究中通过永久结扎双侧颈总动脉血管(2VO)建立的缺血性痴呆动物模型,表现出认知功能障碍明显,淀粉样蛋白前体升高、神经元和脑细胞死亡、tau蛋白过度磷酸化、氧化应激反应和产生慢性炎症等AD病理特征[28-29]。该动物模型病程较长,在行为学表现上如认知功能障碍与AD比较一致,病理上也高度相似,但引起AD的外因在该动物模型中不能体现出来,另外,2VO动物模型手术操作具有一定难度,模型复制后动物存活率低且时间短,不适合给药周期长的实验研究[30]。

另外,还有永久性结扎单侧颈总动脉[30]、去胸腺衰老模型和γ射线致衰老模型[31]、控制性皮质撞击模型[32]、液压脑损伤模型[33]等,由于这些模型在造模方法上复杂、难度高、造模后动物容易死亡、且结果不理想,仅在个别特殊目的实验中有所应用。

4 化学损伤动物模型

主要是以向模型鼠脑部、皮下或腹腔注射特定物质来建立模型,如通过立体定位仪、微透析等方法向实验动物脑内海马、基底核、侧脑室等不同部位注入Aβ片段,鹅蒿蕈氨酸(IBO)、STZ等物质。或通过皮下或腹腔注射D-半乳糖、三氯化铝、冈田酸(OKA)和东莨菪碱(SCOP)等致损物质。

4.1 Aβ诱导模型

Aβ诱导模型是通过在海马CA1区或者侧脑室多次注射Aβ片段诱发Aβ沉积、形成SP为主要病理特点的AD动物模型。Aβ诱导的AD动物模型脑内Aβ沉积明显、Aβ斑块周围星形胶质细胞增生,行为呆滞,易卧,学习记忆能力衰退,出现认知功能障碍、体能衰减明显等AD病理表现[34]。Aβ诱导动物模型,影响因素单一,模型形成时间长,造模过程中,有对脑组织造成穿透性损伤的不确定性,另外,由于注射部位过于集中,使Aβ沉积部位与AD患者Aβ在脑内多区域分布有所不同。

4.2 IBO诱导模型

IBO能对大脑产生毒性作用。特别是对大脑神经元的毒性作用最大,可以导致脑内SP沉积,行动呆慢,学习记忆能力衰退等病理表现[35]。将IBO注入ChE传递和学习记忆能力的主要位点Meynert基底核,通过谷氨酸受体特异激动胆碱能神经元引起神经元损伤、ACh含量和ChAT活性降低,信号通路随之调节异常,认知功能障碍等[36-37]。在实验研究中,IBO联合Aβ复制AD动物模型其临床病理特征更明显[38]。

4.3 STZ诱导模型

在AD患者脑内由于胰岛素分泌异常形成SP和NFT。据此,通过在动物侧脑室注射链脲菌素(STZ)破坏脑部的糖和能量正常代谢,使动物的学习记忆能力衰退,认知功能出现障碍等AD的病理特征[39]。少量STZ影响神经元活性,引起行为学改变、认知功能障碍、能量代谢加速、Aβ异常沉积、胆碱能缺失、tau蛋白过度磷酸化等[40-41]。但有研究认为脑内注射STZ后3个月才能逐渐观察到Aβ沉积,而且SP的形成具有差异性[42]。STZ诱导模型与阿尔茨海默病的普遍特征相符,但由于注射部位在脑,操作难度相对较大,模型复制后动物的存活率相对较低,且模型复制时间相对比较长。

4.4 D-半乳糖模型

D-半乳糖(D-galactose,D-gal)是一种还原单糖,使组织渗透压升高、产生氧化应激和炎症反应,促进神经衰老的发生和发展。通过皮下连续注射D-gal建立亚急性衰老动物模型,导致认知功能和胆碱能功能障碍,产生氧化应激和神经炎症反应,海马区tau蛋白过度磷酸化[43]。D-gal衰老模型与自然衰老模型相比造模时间短、与SAM模型相比具有价格低、结果可靠稳定,有自然衰老动物模型在氧化损伤、神经行为学以及病理形态方面的病理特征等的优点,在实验研究中应用较多。但其缺点是在生化分析中与自然衰老动物模型具有一定的差异[44]。

4.5 铝中毒诱导模型

通过对小鼠侧脑室或腹腔注射AlCl3造成空间学习障碍和记忆损伤建立衰老模型[45],由于脑组织中铝浓度升高使脑内NFT和Aβ聚集加快、神经元变性或凋亡,损伤神经系统功能[46]。但该模型的AD神经病理改变非广泛性[47]。使该模型在应用中具有一定的局限性,现在多与D-半乳糖等其它致衰老模型联合复制衰老模型。

4.6 SCOP诱导模型

SCOP为胆碱能拮抗剂,通过腹腔注射SCOP引起模型动物胆碱能系统功能障碍引起由于氧化应激增加的认知能力的下降[48-49]。由SCOP诱导的痴呆模型被认为是揭示AD相关认知功能障碍的理想痴呆模型[50]。由于此种模型造模方法简单、费用相对较少、所以在对AD认知功能研究中应用比较广泛,缺点是动物模型缺乏AD神经元变性、Aβ沉积等典型病理改变。

4.7 OKA诱导模型

通过在大鼠脑内不同位点注射蛋白磷酸酶的选择性抑制剂OKA诱导Tau蛋白发生过度磷酸化复制AD动物模型,出现ACh活性和表达异常的神经递质系统功能障碍引起的认知功能缺陷[51]。表现出与临床AD病人脑组织中的病理特征相似性。

5 小结

AD的发病机制作为世界研究的热点,至今未明。目前在实验研究中所使用的AD动物模型均不能完全复制AD临床上在的病理特征。多数研究者采用两种或两种以上方法联合复制AD动物模型,以期在动物实验中与临床病理表现尽量相符合,随着对AD研究不断深入及开发防治AD药物的需要,选择合适的动物模型对临床和药物筛选直到积极作用。