ERK磷酸化抑制在改善异氟醚致成年小鼠认知损害中的作用

汤娜娜，李 娟，曹福羊，刘晓梅

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是指麻醉和(或)手术后认知功能的恶化，表现为记忆或注意力障碍，可出现在术后数天或数月内[1,2]。研究发现，有12%认知功能正常的患者在手术后可出现认知功能障碍，其中年龄、麻醉和手术类型等是POCD发生的重要影响因素[3，4]。临床研究表明，吸入麻醉可对实验动物产生神经毒性作用并导致认知障碍，但其发生机制尚不明确[5]。本研究旨在探讨异氟醚对成年小鼠的认知功能损伤、损伤机制及ERK磷酸化抑制在改善异氟醚所致的认知损害中的作用。

1 对象与方法

1.1 对象 选取SPF级健康雄性C57BL/6J P6小鼠66只，体重20～25 g，由北京华阜康生物工程有限公司提供。均饲养于无特殊病原菌环境，温度22～24 ℃，湿度40%～50%，每12 h昼/夜交替，自由摄食水。采用随机数字表法分为3组：对照组(Con组)、异氟醚组(Iso组)、干预组(Iso+U0126)，每组22只。本研究经北京军事医学科学院实验动物管理委员会批准，动物处置过程符合伦理学要求。

1.2 方法 Iso组和Iso+U0126组小鼠置于1个带进出口的密闭树脂盒，通过气体流量计和异氟醚独立挥发罐将1.4%异氟醚(CAS：26675-46-7；麦克林公司生产)+60%氧气+38.6%空气混合通入树脂盒，对小鼠进行麻醉处理2 h；Iso+ U0126组小鼠于异氟醚处理前30 min，腹腔注射100 mg/kg U0126(MEK1/2抑制剂)预处理。Con组小鼠置于同样树脂盒，仅给予60%氧气+40%空气处理2 h。采用Vamous麻醉气体监测仪(德国Drager公司)监测异氟醚及O2浓度。

1.3 检测指标

1.3.1 β淀粉样蛋白1-42(amyloid β protein 1-42, Aβ1-42)水平检测 造模结束后每组随机选取6只小鼠心脏灌流后断头，取皮层样本，称重加入预冷的组织蛋白裂解液匀浆，4 ℃,14 000 r/min,离心10 min后取上清，采用BCA法测定样本浓度。每组再随机选取4份皮层样本，采用ELISA法测定β淀粉样蛋白42(Aβ1-42)表达水平。所有试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.3.2 蛋白免疫印迹试验检测磷酸化细胞外信号调节激酶1(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1, p-ERK1)水平 3组取上述皮层样本采用Western blot法检测皮层p-ERK1表达情况。将等量蛋白(50 μg)加入SDS上样缓冲液中，70 ℃恒温加热10 min使其变性。经SDS-PAGE电泳分离、转膜、封闭后加入小鼠抗磷酸化ERKl单克隆抗体(1∶1000，美国Cell Signaling公司) 4 ℃过夜，漂洗后加入羊抗鼠二抗(1∶2000，美国Sigma公司)，室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光显影，定影，采用美国Bio-Rad图像分析系统扫描，照相。以目的条与内参β-actin条带灰度值的比值反应目的条带的表达水平。

1.3.3 免疫荧光法检测p-ERK1水平 造模结束后每组随机选取6只小鼠心脏灌流后断头，将小鼠皮层剥离后用4%多聚甲醛固定24 h，20%蔗糖脱水4 h,30%蔗糖脱水4 h，制成厚度为5 μm的冰冻切片。固定、破膜、封闭后，添加兔抗p-ERKl单克隆抗体(1∶1000，美国Cell Signaling公司)。将载玻片放在湿盒中， 4 ℃冰箱中过夜。洗涤3次后，加入山羊抗兔抗体(1∶1000，美国Cell Signaling公司)，37 ℃孵育1 h。在室温下用DAPI(104139，Abcam)孵育5 min。滴加抗荧光淬灭剂后封片，在荧光显微镜下随机选取3个视野进行观察，对视野中绿色荧光表示的p-ERK1+细胞和蓝色荧光表示的总细胞进行计数，实验结果以p-ERK1+细胞数/DAPI+细胞数×100%表示。

1.3.4 水迷宫实验 水迷宫系统(Haslings 公司，美国)为直径150 cm、高60 cm的黑色圆柱形水池，池壁上以4个等距点将水池平均分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限，平台置于第Ⅰ象限中央，直径10 cm，低于水面1 cm。水中加入白色染料拌匀，保持水温25 ℃，训练期间平台位置和水池周围参照物保持不变。水迷宫实验共7 d，第1～7 天行定位航行实验，小鼠面向池壁分别从第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限入水点入水，间隔15 min，记录小鼠从入水到找到平台的时间。当逃避潜伏期超过 90 s，则引导小鼠至平台并停留 10 s，时间记为90 s，取4次逃避的平均值为逃避潜伏期。第7天同时行空间探索实验：撤除平台，于第Ⅰ象限中点将小鼠面向池壁放入水中，记录其30 s 内穿越平台次数[6]。

2 结 果

2.1 小鼠皮层p-ERK1和Aβ1-42表达水平比较 WB和免疫荧光实验结果提示(图1)，与Con组比较， Iso组Aβ1-42水平显著升高，小鼠皮层p-ERK1的表达水平显著升高，差异有统计学意义 (P<0.05)。与Iso组比较，Iso+U0126组Aβ1-42表达无统计学差异，皮层p-ERK1水平显著下降(P<0.05，表1)。

表1 各组小鼠皮层p-ERK1和Aβ1-42表达水平比较

2.2 小鼠逃避潜伏期和穿越平台次数的比较 造模后第2～7天，与Con组相比，Iso组小鼠逃避潜伏期显著延长，穿越平台次数显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与Iso组比较，Iso+U0126组小鼠逃避潜伏期显著缩短，穿越平台次数显著增加，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

图1 3组小鼠皮层p-ERK1表达水平比较 Con组为对照组，Iso组为异氟醚组， Iso+U0126组为干预组

表2 三组小鼠逃避潜伏期和穿越平台次数的比较

3 讨 论

异氟醚通过调节NMDA型谷氨酸受体，在中枢神经系统中产生镇痛和麻醉作用[7-9]。有研究发现， NMDA型谷氨酸受体在学习和记忆过程中有关键作用，也可能在麻醉诱导的大脑认知缺陷中发挥作用[10]。有研究指出，麻醉药物处理下的氧化应激反应对细胞外信号调节激酶磷酸化的水平的改变可能是神经元凋亡的潜在原因[11]。

本研究参考临床常用的异氟醚浓度(正常成年人的最低肺泡浓度1.15%)，对照文献[12]标准进行模型，选取出生后2月龄的C57BL/6J小鼠作为实验对象，进行1.4%异氟醚连续2 h处理。研究表明异氟醚可剂量依赖性地损伤海马突触可塑性和增加炎性反应水平，导致海马相关性认知损伤[13]。本研究结果表明，Iso组小鼠造模24 h后连续7 d的逃避潜伏期较Con组显著增长，穿越平台次数显著减少，提示小鼠经过异氟醚处理后，海马相关的认知功能受到显著损害。

Aβ1-42是与认知功能和脑损伤有关的蛋白，其在阿尔茨海默病、炎性脑病、脑缺血再灌注损伤中均可明显增高[14]。ERK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其主要包括ERK1和ERK2两种亚型，可将细胞外刺激传递给细胞内并调节多种细胞功能。大脑中Aβ的异常累积同时会上调p-ERK的水平，而通过抑制Aβ激活的p-ERK水平，可提高小鼠海马齿状回区神经元的存活数量，提高小鼠学习能力和空间记忆能力[15]。本研究采用ELISA法检测皮层Aβ1-42含量，经典WB法和免疫荧光实验检测各组小鼠皮层p-ERK1水平。结果显示，与Con组相比，Iso组小鼠皮层Aβ1-42含量升高，p-ERK1水平显著升高，说明异氟醚致成年小鼠皮层Aβ异常累积，并致ERK磷酸化水平上调。

U0126是一种常用的MAPKK抑制剂，即MAPK 激酶抑制剂或MEK1/2抑制剂。U0126可以通过细胞选择性抑制MEK1/2，从而抑制MAP 激酶 (ERK1/2即p44/42 MAPK)的磷酸化和激活[16]。在本研究中，相比Iso组，Iso+U0126组小鼠皮层Aβ1-42水平无显著变化，而p-ERK1的水平显著降低，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数显著增多，表明预先给予U0126可改善异氟醚处理后Aβ1-42异常累积所致的p-ERK1水平上调及认知功能障碍。

综上所述，1.4%异氟醚连续2 h处理可致成年小鼠认知功能障碍，其机制可能与Aβ1-42异常累积致ERK磷酸化水平升高有关，而通过预先抑制ERK磷酸化水平可改善异氟醚所致的认知功能损害。本研究初步探讨了吸入麻醉诱导POCD的相关机制，而ERK作为新靶点可能为临床预防或治疗POCD的发生提供新的方向，下一步将进行更全面的研究。