基于电子鼻与GC-MS分析精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性风味成分的差异性

贝翠平 ，柳艳霞 *，赵改名 ，张丽萍 ，张忆臻

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450002）

美拉德反应是一种非酶促褐变反应，发生在食品的烹调、加工以及储藏过程中，并对其风味、颜色、质构、营养等性质产生重要的影响[1-2]。除了对高温条件的美拉德反应的研究外[3-6]，部分学者开始对温和美拉德反应的产物展开了一系列研究[7-8]。温和美拉德反应在发酵肉制品成熟过程中具有重要作用，其反应过程、反应产物的性质和反应温度、时间、pH值等有关[9]，美拉德反应生成的产物非常复杂[10]，要建立单一模拟反应再对其反应物的性质及形成机理等方面进行研究[11]。精氨酸是碱性氨基酸，对香味形成有很大贡献[12]，有研究报道金华火腿中的游离精氨酸可以和葡萄糖发生美拉德反应[13]，反应产物对火腿风味的形成具有很大的影响。现在精氨酸的研究大多都是对美拉德产物抗氧化性的研究[14-15]，而对于温和条件下精氨酸-美拉德反应挥发性风味的变化研究较少。因此本文选取精氨酸和葡萄糖为反应底物，构建温和条件下精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系。

固相微萃取-气相色谱-质谱联用和电子鼻技术是研究食品中挥发性物质常用的检测方法。气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）主要用于挥发性物质的定性和半定量分析[16]，电子鼻技术是一种用途广泛、实时快速无损的风味物质分析检测方法[17]；该技术已用于肉制品[18]、食用油[19]、酒[20]、水果[21-22]、牛奶[23]等食品的风味分析中。把GC-MS和电子鼻相结合研究温和条件下精氨酸-美拉德反应体系挥发性物质的相关报道较少。为此，本研究以金华火腿成熟时最高温度40℃为反应温度，反应时间为10 d至60 d等6个时间点，采用电子鼻和GCMS技术对精氨酸-葡萄糖体系样品挥发性成分进行分析，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）建立挥发性风味物质的评价模型，为研究温和条件下精氨酸美拉德反应提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

D-（+）-葡萄糖（纯度≥99.50%）、L-精氨酸：美国Sigma-Aldrich公司；2-甲基-3-庚酮（内标化合物）：艾吉析科技（上海）有限公司；磷酸盐缓冲溶液（0.2 mol/L，pH 6.0）：国药集团化学试剂有限公司；0.22 μm滤菌膜：天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 仪器与设备

DNP-9272型电热恒温培养箱：上海精宏实验制备有限公司；PEN3便携式电子鼻系统：德国Airsense公司；75μmCAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司；7890A/5975B气相色谱-质谱联用仪：安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验方法

模拟体系的制备：将D-（+）-葡萄糖和L-精氨酸分别溶解于pH6.0、浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液，经0.22 μm滤菌膜过滤除菌后分别移取一定体积葡萄糖和氨基酸溶液于15 mL的顶空瓶中混合均匀，置于40℃的培养箱中恒温培养。反应时间设置为10、20、30、40、50、60 d，样品反应结束后置于-25 ℃冰箱终止反应，测定挥发性产物。

1.3.2 测定方法

1.3.2.1 挥发性产物GC-MS分析

内标溶液的配制：精确称取2-甲基-3-庚酮25 mg溶于10.0 mL甲醇中，制成浓度为1.25 mg/mL的2-甲基-3-庚酮内标溶液，置于4℃冰箱备用。

挥发性产物固相微萃取：将固相微萃取装置中的萃取头在气相色谱进样口250℃处老化0.5 h。萃取头插入15 mL顶空瓶并缓慢推出吸附纤维头（注意不能碰到任何物质），50℃恒温吸附45 min，随即缓慢收回萃取头后插入气相色谱仪，进样口温度250℃处解析5 min。

色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25 μm），载气 He，流速 1 mL/min、不分流，恒流。进样口和接口温度250℃，升温程序为：起始温度40℃保持3 min；以5℃/min升温至60℃，以8℃/min升温至180℃，以10℃/min升温至240℃，保持6 min。

质谱条件：电离方式为EI，电子能量70 eV，灯丝电流 100 μA，扫描质量范围：33～400 m/z。

数据分析：将GC-MS分析图谱经计算机和人工把检出的每个峰与NISTDEMO图谱库进行比较，相似指数（similarity index，SI）在800以上者为确定的化合物；通过计算待测挥发物与内标物的峰面积之比求得其浓度，计算公式如下。

浓度/（ng/g）=峰面积比（挥发物/内标物）×1.25 μg（内标物）×1 000/6g（样品质量）

1.3.2.2 挥发性产物电子鼻分析

电子鼻由10种金属氧化物传感器构成，每种传感器对不同种类物质的敏感性存在差异，具体性能如表1 所示[24]。

表1 化学传感器及相应的敏感物质类型Table 1 Chemical sensors and the corresponding types of volatile substances

参照党亚丽[25]的试验方法，将15 mL顶空瓶用3层保鲜膜封口，将样品在50℃恒温水浴锅中平衡30 min，干燥空气作为载气，采样时间间隔为1 s，清洗时间120 s，归零时间5 s，样品测定时间80 s，进样流速为300 mL/min。

1.4 数据处理

试验数据采Origin2018和SPSS25进行处理与统计分析，并采用Origin2018软件绘制聚类热图和传感器堆积图。

电子鼻数据分析：采用SPSS25进行PCA和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）分析，将数据标准化后确定特征根、特征向量，根据各主成分值和主成分贡献率得出各个反应时间挥发性成分的评价模型，计算出不同反应时间样品的综合得分。

2 结果与分析

2.1 精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系电子鼻分析

2.1.1 PCA分析

PCA是将电子鼻数据进行降维处理，将主要信息保留在几个不相关的主成分中[26]。一般前2个主成分包含了原始数据的主要信息[27]。旋转后的载荷因子见表2。

表2 旋转后的载荷因子Table 2 Load factor after rotation

由表2可知，精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系第1主成分主要反映氮氧化物和硫化合物等化合物信息，第2主成分主要反映芳烃化合物、硫的有机化合物和氢化物等信息，此结果和张凤梅等[28]的研究结果存在差异，可能是由氨基酸的种类和性质不同造成的。精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性产物主成分分析见图1。

图1 精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性产物主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile products in Maillard reaction system of arginine-glucose

由图1可知，主成分1的贡献率为69.242%，主成分2的贡献率为19.84%，累计贡献率为89.082%，因此，应选用前2个主成分的数据作为数据分析的有效成分。10 d和20 d、30 d和40 d、50 d和60 d 3组相邻的时间点数据在主成分2上较为接近，但在主成分1上差异明显，说明在20 d和30 d之间、40 d和50 d之间反应生成的物质发生了明显的变化。

2.1.2 LDA分析

LDA是利用所有传感器的信号研究样品所属类别的一种统计方法。精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性产物LDA分析见图2。

图2 精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性产物LDA分析Fig.2 LDA analysis of volatile products in the Maillard reaction system of arginine-glucose

由图2可知，LDA1和LDA2的贡献率分别为66.9%和28.4%，累计贡献率达到95.3%基本代表原始变量的绝大部分信息。在LDA1上50 d和60 d与其它时间点距离较远，说明在反应过程中挥发性物质丰度逐渐减小。而30 d与40 d样品在LDA1上距离较近，但在LDA2上则可完全分开。通过电子鼻对不同反应时间的挥发性成分进行分析，发现PCA和LDA均能很好地区分30 d和40 d的样品。但利用LDA不能很好地区分其它反应时间之间的挥发性成分，PCA则能进行明显区分，说明PCA是辨别不同反应时间精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性成分差异的有效分析方法。

2.2 精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性产物GCMS分析

2.2.1 挥发性成分种类及含量分析

挥发性成分种类及含量分析见表3和表4。

表3 精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系不同反应时间挥发性化合物分析结果Table 3 Analysis results of volatile compounds in the Maillard reaction system of arginine-glucose at different reaction times

续表3 精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系不同反应时间挥发性化合物分析结果Continue table 3 Analysis results of volatile compounds in the Maillard reaction system of arginine-glucose at different reaction times

表4 不同反应时间精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性成分种类数与含量Table 4 Number and content of volatile components in Maillard reaction system of arginine-glucose with different reaction times

由表3和表4可知，6个反应时间点共检测出50种挥发性物质，大致可分为6大类，分别是醇类、醛类、酮类、酯类、烃类、其它。10、20、30、40、50 d 和 60 d 中分别检测到 27、19、23、19、23 种和 18 种化合物。20 d 时总挥发性成分含量最高（1 989.1 ng/g），其次是10 d（1 848.5 ng/g）、60 d（1 472.39 ng/g）、40 d（1 442.7 ng/g）、30 d（1 373.5 ng/g）及 50 d（942.07 ng/g）。其中含量最高的是酯类，主要包含乙酸乙酯、亚硝酸仲丁酯和己酸-2-苯乙酯；其他类物质次之，主要包含乙二醇二乙醚和乙醚。由表4可知，10 d生成的挥发性化合物种类最多（27种），其次是30 d和50 d（23种）。

醇类是精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性物质中含量排名第三的物质，其前体物质主要是多不饱和脂肪酸[29]。在20 d中醇类物质含量最高到可达到389.7ng/g，其中乙醇是主要挥发性物质（185.04 ng/g），其次是（3-叔丁基-5-羟基甲基-环己-2-烯基）-甲醇和1-环己基-2-丁烯-1-醇。30 d醇类含量达到226.48 ng/g，仅次于 20 d。

醛类物质气味阈值较低，具有脂香气味，是肉类香气的指标[30]。但是精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系中醛类含量较少，对总体挥发性成分的贡献暂不能确定。但有研究表明许多Strecker醛本身及其反应产物对于食品香料有着非常重要的作用[31]。醛类物质在10 d到20 d呈上升趋势，随着反应时间的延长含量却减少，可能是醛类和后续生成的物质发生反应，从而导致醛类含量的下降。糠醛含量是表征食品变质程度、食品储藏时间长短的一项重要指标[32]，其中甘氨酸对半胱氨酸-木糖[33]反应也检测到了糠醛的存在。己醛[34]具有青草味、香脂，最高含量达到111.96 ng/g，而邓仕彬[35]的研究中也检测到己醛的存在，含量达到2.12 ng/mL，两者因为体系不同导致己醛含量也不尽相同。

酮类的来源一方面可能是由醇类氧化，另一方面可能是脂类分解产生的[36]，短链酮类具有脂香和焦香香气而长链酮类则呈现花香气息[37]。酮类物质在20 d和50 d时生成的较多，是美拉德反应的重要产物[38]，由表4可知醛类物质的含量高于酮类物质，由于酮类的阈值一般高于其同分异构体的醛类[39]，所以酮类对风味的贡献相对于醛类物质作用相对不大。随着反应时间的延长，酮类物质的含量20 d和50 d较高，分别为114.51ng/g和104.15 ng/g。丙酮是重要的美拉德反应产物，其含量在20 d时达到最高96.52 ng/g，而崔和平[40]的研究因氨基酸种类和处理方式不同导致检测到丙酮含量达到 32.05 （μg/L）。N-（4-bromobut-1-yl）piperidin-2-one在反应中的不同时间点均有产生，（1S-顺）-1-（2，2，6-三甲基环己基）乙酮只有在 50 d时检测到，而丙酮在20 d和50 d中检测到，其中苯乙酮具有杏仁味和坚果味，在袁林等[41]的研究中也有发现，且相对含量达到0.95%。有研究表明酸和醇发生酯化反应产生酯类物质[42]，且酯类物质能够使食品具有甜香气味和轻微油脂气味[43]。由表4可知，精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系中酯类化合物含量最高，此结果与张佳敏等[44]研究结果一致。酯类物质中含量较高的是乙酸乙酯，具有水果味、甜味[45]。

酯类物质在10 d和20 d中含量较多而在50 d时含量最少，可能是随着反应时间的延长，一些复杂的化学反应导致了酯类在一定程度上的降解。由表3可知，精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系中共检测出烃类化合物有11种。随着反应时间的延长，烃类物质大致呈现下降趋势，且在30 d时达到最低，50 d次之。烃类物质在精氨酸-葡萄糖美拉德体系中含量较低但是阈值较高，在整体上对精氨酸-葡萄糖美拉德体系挥发性成分影响不大。但是有一些烃类也具有独特的风味，如在50 d中检测到的（+）-柠檬烯具有新鲜橙子香气及柠檬香气[46]。不同反应时间聚类热图见图3。

聚类热图能直观地表明6个时间点中各特征香气浓度的差异。由图3可知，根据横向分析发现10 d和50 d 特征香气成分差异明显，可分为Ⅰ（10d）、Ⅱ（20、30、40、60 d）和Ⅲ（50 d）三大类。根据纵向分析发现，可将特征香气成分分为Ⅰ[AD～J即（+）-柠檬烯～戊醛]、Ⅱ（AF～B即 2，4-二甲基己烷～1-丁醇）、Ⅲ（AC～C即乙基苯～4-氨基-1-戊醇）和Ⅳ（O～A即丙酮～乙醇）4个系列。Ⅰ系列含有戊醛和糠醛，呈现刺激性气味都是50 d独有的物质。Ⅱ系列多以醇类酯类为主；Ⅲ系列含有的己醛[34]和乙酸乙酯[47]具有青草味、香脂味和苹果果皮味，反应10 d和20 d的样品含量最多，可能是随着反应时间较长，生成的物质与二者反应，使得含量下降。Ⅳ系列含有乙醇和丙酮。

图3 精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系不同反应时间聚类热图Fig.3 Clustering heat map of arginine-glucose Maillard system with different reaction times

2.2.2 PCA分析

2.2.2.1 不同反应时间的精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性成分PCA

主成分的特征值与贡献率见表5，主成分的特征向量与载荷矩阵见表6。

表5 主成分的特征值及贡献率Table 5 Eigenvalues and contribution rates of principal components

表5可知，第1、第2、第3主成分的贡献率分别为58.234%、25.638%、11.96%，累计贡献率达到95.832%，基本代表原始变量的绝大部分信息。主成分的载荷值的大小代表该主成分对该类物质反映程度的大小[48]。

由表6可知，PC1主要反映醇、醛和酮类等指标；PC2主要反映的是烃类化合物；PC3主要反映的是酮类化合物。PC1与醇类呈正相关；PC2与烃类呈正相关；PC3与酮类呈负相关。

表6 主成分的特征向量与载荷矩阵Table 6 The eigenvectors and loading matrix of the principal components

2.2.2.2 挥发性成分品质评价模型的建立

根据主成分6类物质的特征向量，可以得到各个主成分的得分，分别用Y1、Y2和Y3表示，进行挥发性成分含量的综合评价，得到精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性成分的线性关系式分别为：Y1=0.530X1＋0.483 X2＋ 0.438 X3＋ 0.405X4＋0.355 X5-0.068 X6；Y2=-0.067 X1+0.281X2-0.108 X3－ 0.362 X4＋0.414 X5+0.777 X6；Y3=0.063 X1-0.270X2-0.645 X3+0.436 X4+0.558X5-0.080 X6。

6类物质的权重分别为0.582、0.256、0.120。将这6个指标分别与权重相乘，结果相加得出Y综合值，建立精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性成分评价模型：F=0.582F1＋ 0.256F2＋ 0.120F3，得到的综合得分见表7。

由表7可知，20 d的第1主成分得分最高，10 d其次，第2和第3主成分得分最高的均是10 d。由评价模型可得，精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系挥发性化合物综合得分排名依次为 20、10、60、40、30、50 d。所以，反应时间为20 d时精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系的挥发性成分品质最好。

表7 标准化后主成分综合得分Table 7 The comprehensive scores of principal and principal components after standardization

3 结论

电子鼻结果与GC-MS的结果互相映证，得出不同反应时间下精氨酸-葡萄糖美拉德反应体系样品挥发性成分和含量存在差异。PCA可以良好区分不同反应时间的样品，而LDA仅能较好地区分30 d和40 d的样品。利用GC-MS技术分析了不同反应时间挥发性物质的含量与组成，共检测出50种挥发性化合物，在10、20、30、40、50 d 和 60 d 中分别检测到 27、19、23、19、23、18 种化合物，可分为醇类、醛类、酮类、酯类、烷烃类和其它类化合物，其中20 d的挥发性物质含量最高，达到1 989.1 ng/g。通过PCA建立的挥发性成分综合评价模型，得出20 d挥发性成分含量得分最高。