索骨丹中黄酮的抗氧化活性分析*

张 韫，杨 秀，刘 学，史瑞萌，马晓彤

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

索骨丹，又名水五龙、慕荷、牛角七等，是虎耳草科植物七叶鬼灯檠的根茎，有凉血止血，消肿解毒等作用，内用可治疗甲状腺肿、咽喉肿痛，外用可治疗外伤出血、子宫脱垂等[1]。索骨丹中含有多元酚、蒽醌、黄酮、多糖等多种成分，黄酮是其主要成分之一[2]。索骨丹中的黄酮具有良好的抗氧化性，对自由基能起到清除作用，同时可防止细胞衰老退化并增强免疫力[3]。

实验主要用超声提取法提取索骨丹中的黄酮，然后以黄酮为抗氧化剂(自由基清除剂)，用荧光和紫外光谱法测定索骨丹黄酮对羟自由基、亚硝酸盐、超氧阴离子的清除及对铁离子还原能力，并与经典抗氧化性剂(维生素C)对比，分析评价索骨丹中黄酮的抗氧化性。实验从清除自由基能力的角度评价索骨丹黄酮的体外抗氧化活性，为索骨丹药材的深入开发利用及大规模工业化生产提供理论依据，对新型食品添加剂的研发也具有重要意义。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

索骨丹药材：经西安医学院汪兴军老师鉴定为七叶鬼灯檠的根茎；芦丁：纯度98%，批号20140919，士锋生物科技有限公司；焦性没食子酸、N-1-萘乙二胺盐酸盐：分析纯，科密欧化学试剂有限公司；苯甲酸：分析纯，北联精细化学品开发有限公司；无水对氨基苯磺酸：分析纯，天力化学试剂有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：纯度99.7%，阿拉丁化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯，市售。

紫外-可见分光光度计：UV-762，酸度计：PHS-3C，上海佑科仪器仪表有限公司；荧光分光光度计：LS-55，美国PerkinElmer有限公司；旋转蒸发器：RE-2000A，循环水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，予华仪器有限责任公司；高速万能粉碎机：FW200A，北京科伟永兴仪器有限公司；电热恒温水浴锅：黄骅航天仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集与处理

索骨丹药材粉碎过250 μm筛，得索骨丹粉末。称取30 g索骨丹粉末置于索氏提取器中，加入3倍体积的石油醚回流去除脂质，至石油醚呈无色，挥干溶剂备用。称取处理后的索骨丹粉末5 g置于锥形瓶中用乙醇作为提取溶剂，以超声法提取总黄酮，并旋蒸浓缩溶剂至20～30 mL，得索骨丹黄酮提取液。采用真空干燥法烘干溶剂用分析天平准确称量，确定黄酮的浓度。

1.2.2 紫外-可见分光光度法测定索骨丹黄酮的抗氧化能力

1.2.2.1 索骨丹黄酮对羟自由基的清除能力

Fenton反应产生的羟自由基与加入的水杨酸生成2，3-二羟基苯甲酸，该物质在510 nm处有紫外-可见区吸收[4-5]。如在反应体系中加入抗氧化物质降低体系中的羟自由基浓度，就会降低2，3-二羟基苯甲酸浓度，导致510 nm处的吸光度减小。

精密吸取1.0 mLc(FeSO4)=8.8 mmol/L溶液于试管中，依次加入1.0 mLc(水杨酸)=9.1 mmol/L溶液、1.0 mL索骨丹提取溶液、5.0 mL蒸馏水振荡混匀后加入1.0 mL质量分数 0.06% H2O2溶液，避光条件下37 ℃水浴30 min，于510 nm处测定吸光度A1；将索骨丹提取溶液替换成等量蒸馏水，测得吸光度为A0。清除率的计算见公式(1)，同法测定相同质量浓度下维生素C的清除率。

(1)

1.2.2.2 索骨丹黄酮对亚硝酸盐的清除能力

在2个10 mL的容量瓶中均加入5.0 μg/mL的NaNO22 mL，其中一个容量瓶中加入5 mL黄酮提取液，摇匀放置10 min，另一份作空白。两瓶内均加入2 mL质量分数0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀放置5 min，再加入1 mL质量分数0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加水定容，静置15 min。在583 nm处测吸光度，加黄酮提取液的溶液测得吸光度A1，未加黄酮提取液的溶液吸光度A0，以公式(1)计算清除率[4-7]，同法测定相同浓度下维生素C的清除率。

1.2.2.3 索骨丹黄酮对超氧阴离子的清除能力

将1.0 mL不同浓度黄酮提取液加入2.5 mLc(Tris-HCl)=50 mmol/L缓冲液(pH=8.2)，定容于25 mL容量瓶。在25 ℃下反应20 min，再加入1.0 mLc(邻苯三酚)=3.0 mmol/L溶液反应5 min，加入HCl溶液终止反应，在325 nm处测定吸光度记为A1，用等体积的蒸馏水代替黄酮提取液，测得吸光度为A0，代入公式(1)计算清除率，同法测定相同浓度下维生素C对超氧阴离子的清除率[8]。

1.2.2.4 铁离子还原能力(FRAP)测定

FRAP工作液的配制：0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液，以体积比10∶1∶1比例混合配制FRAP工作液，现配现用。

FeSO4标准曲线的绘制：吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL FeSO4溶液各0.1 mL，加入3.0 mL FRAP工作液，3.0 mL蒸馏水，37 ℃反应5 min。以蒸馏水代替FeSO4加入FRAP工作液为空白，于593 nm处测定吸光度。以质量浓度ρ(mg/mL)为横坐标，以吸光度值A为纵坐标，绘制FeSO4标准曲线。标准曲线回归方程为A=1.47ρ+0.07，相关系数R=0.999 1。

样品的抗氧化活性(FRAP值)以达到相同吸光度所需FeSO4的物质的量表示(mmol)。取不同质量浓度的黄酮样品溶液0.030、0.060、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL 0.1 mL，用上述FeSO4的方法测定抗氧化能力。根据FeSO4标准曲线计算出对应FeSO4溶液的浓度，样品的抗氧化活性以达到同样的吸光度数值为FRAP值[9-10]。同法测定相同质量浓度下维生素C的抗氧化活性。

1.2.3 荧光分光光度法测定索骨丹黄酮的抗氧化能力

1.2.3.1 索骨丹黄酮对羟自由基的清除能力

在10 mL的比色管中，依次加入pH=5.47 KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液2.0 mL，c(苯甲酸)=1.0 mol/L溶液2.0 mL，c(FeSO4)=1.0 mmol/L溶液0.6 mL，质量分数0.3% H2O2溶液1.2 mL，加蒸馏水定容至刻度，混匀，反应2 h，进行荧光光谱扫描确定最大激发波长及发射波长[5]。

按上述方法加入试剂，以λex=290 nm、λem=598 nm为测定波长，狭缝均为10 nm，扫速为300 nm/min，测定上述体系的荧光强度F，计算其与空白参比溶液(苯甲酸与缓冲溶液)荧光强度F0之差ΔF，由此可间接求得Fenton体系所产生羟自由基的量[11-12]。于上述的Fenton体系中，加入不同浓度的索骨丹黄酮提取液再加入FeSO4溶液，同法测定荧光强度Fs，则羟自由基清除率的计算见公式(2)。

(2)

1.2.3.2 索骨丹黄酮对超氧阴离子的清除能力

在第1个试管中加入索骨丹的黄酮提取液和0.8 mLc[Al(NO3)3]=1.0 mmol/L溶液摇匀，稀释至5 mL，5 min后以λex=320 mm、λem=596 nm为测定波长，狭缝10 nm，扫速300 nm/min，测其荧光强度F0。在另一试管中加入pH=8.2 Tris-HCl 缓冲液2.0 mL，在25 ℃中加热10 min，再加入预热过的c(邻苯三酚)=0.3 mmol/L溶液0.1 mL，立即加入不同浓度的黄酮提取液，反应4 min后加入c[Al(NO3)3]=1.0 mmol/L溶液摇匀，稀释至5 mL，测其荧光强度F1。计算清除率见公式(3)。

(3)

2 结果与讨论

2.1 紫外分光光度法的测定结果

2.1.1 对羟自由基清除的测定

紫外光谱法测定黄酮对羟自由基清除率，见图1。

ρ/(μg·mL-1)图1 紫外光谱法测定黄酮对羟自由基清除率

由图1可知，索骨丹黄酮对羟自由基的清除率随质量浓度的不断增大而增大，ρ(索骨丹黄酮)=16 μg/mL，清除率可达63.54%；ρ(维生素C)=16 μg/mL时清除率为55.52%。质量浓度范围相同，索骨丹黄酮对羟自由基的清除能力优于维生素C的清除能力。

2.1.2 对亚硝酸盐清除的测定

ρ/(μg·mL-1)图2 紫外光谱法测定黄酮对亚硝酸盐的清除率

由图2可知，ρ(索骨丹黄酮)=1～6 μg/mL，对亚硝酸盐的清除率是随质量浓度的增大而增大，最高可达66.38%，ρ(索骨丹黄酮)=6～14 μg/mL，对亚硝酸盐的清除率呈平稳趋势，基本保持在约66%；ρ(维生素C)=1～4 μg/mL，对亚硝酸盐的清除率随质量浓度的增大而迅速增大，ρ(维生素C)=4～14 μg/mL，清除率上升趋势减缓，其清除率最高可达52.55%，可以看出，质量浓度范围相同，索骨丹黄酮对亚硝酸盐的清除能力优于维生素C。

2.1.3 对超氧阴离子清除的测定

邻苯三酚发生自氧化反应生成超氧阴离子，在325 nm处有最大紫外吸收。如在体系中加入能清除超氧阴离子的物质可以使生成的超氧阴离子含量降低，从而导致吸光度降低。因此，可通过测定325 nm处吸光度的判断索骨丹中黄酮对超氧阴离子的清除能力，见图3。

ρ/(μg·mL-1)图3 紫外光谱法测定黄酮对超氧阴离子的清除率

由图3可知，ρ(索骨丹黄酮)=1～16 μg/mL，对超氧阴离子的清除率随质量浓度的增大而增大，拐点位于2.5 μg/mL，清除率最高可达87.66%；ρ(维生素C)=1～10 μg/mL，对超氧阴离子的清除率是随质量浓度的增大而增大，ρ(维生素C)=10～16 μg/mL，清除率随质量浓度的增大基本不变甚至有下降趋势，其最大清除率达71.22%。质量浓度范围相同，索骨丹黄酮对超氧阴离子的清除能力优于维生素C。

2.1.4 对铁离子还原能力的测定

Fe3+与TPTZ在酸性条件下无颜色反应，加入抗氧化物质时发生还原反应生成蓝色Fe2+-TPTZ，在593 nm处有紫外吸收。测定593 nm吸光度就可以确定总抗氧化能力，见图4。

ρ/(μg·mL-1)图4 铁离子还原能力测定

由图4可知，ρ(索骨丹黄酮)=0.03～0.5 μg/mL，对铁离子的还原随质量浓度的增大而迅速增大的，ρ(索骨丹黄酮)=0.5～1.0 μg/mL清除率趋于平稳；ρ(索骨丹黄酮)=0.03～0.5 μg/mL，对铁离子的还原随质量浓度的增大而迅速增大，ρ(索骨丹黄酮)=0.5～1.0 μg/mL，清除率趋于平稳，FRAP最大值为0.372。在该质量浓度范围索骨丹黄酮对铁离子的还原能力依然优于维生素C的清除能力。

2.2 荧光光谱法的测定结果

2.2.1 对羟自由基清除的测定

实验发现索骨丹黄酮对体系的荧光有猝灭作用。以ρ(索骨丹黄酮)为横坐标，对羟自由基的清除率为纵坐标作图，见图5。

由图5可知，ρ(索骨丹黄酮)=26～433 μg/mL，索骨丹黄酮对羟自由基的清除率是随质量浓度的增大而增大，ρ(索骨丹黄酮)=433 μg/mL清除率最大，达95.54%。

ρ/(μg·mL-1)图5 荧光光谱法测定黄酮对羟自由基的清除率

2.2.2 对超氧阴离子清除的测定

以ρ(索骨丹黄酮)为横坐标，对超氧阴离子清除率为纵坐标作图，见图6。

ρ/(μg·mL-1)图6 荧光测定黄酮对超氧阴离子的清除率

由图6可知，ρ(索骨丹黄酮)=0～65 μg/mL，清除率随质量浓度增大而增大，ρ(索骨丹黄酮)=65 μg/mL，索骨丹黄酮对超氧阴离子的清除率最大达77.67%，随后随着质量浓度的增大清除率逐渐减小。

3 结 论

实验采用紫外-可见分光光度法和荧光分光光度法，以维生素C为对照，测定索骨丹黄酮对自由基的清除能力。结果表明索骨丹的黄酮对超氧阴离子、羟自由基、亚硝酸盐3种自由基具有一定的清除能力且对铁离子有较好的还原能力，且清除作用随质量浓度增加而增强，均优于经典抗氧化剂维生素C，具有良好的抗氧化活性。对陕西地方药材索骨丹的深度开发及抗氧化研究提供了理论基础和实验参考。