白背飞虱雌雄成虫肠道可培养细菌种类组成及差异分析

徐天梅，黄 钰，肖关丽*，陈 斌*

(1. 云南农业大学植物保护学院，云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南昆明 650201；2. 云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201)

白背飞虱Sogatellafurcifera(Horváth)，属于半翅目同翅亚目飞虱科，有较强的迁飞性，是水稻上的重要害虫。该虫可以在水稻、麦类、高粱、玉米、稗草等18种作物和杂草上完成生活史(徐安隆等，2015)。

昆虫肠道是取食、消化和吸收营养物质的场所，含有多种微生物，这些微生物在昆虫的营养代谢、生长发育及生殖行为等方面发挥至关重要的作用(李香香等，2011)，其中细菌所占的比率超过九成(Egertetal.，2003)。昆虫与肠道细菌相互依赖、相互影响、共同进化(Baumannetal.，1995)，昆虫为肠道细菌提供稳定的生活环境和补充营养物质(Kaltenpothetal.，2014)，肠道细菌则帮助宿主合成营养物质、参与宿主免疫防御和生殖代谢(Fragoetal.，2012)。例如小菜蛾Plutellaxylostella肠道细菌可以促进虫体的生长发育(沈金洪等，2018)，而且能够介导宿主小菜蛾对农药毒死蜱的抗性(Xiaetal.，2018)，并通过产生脂酶降解茚虫威杀虫剂(Ramyaetal.，2016)。

杨晓晴等(2018)基于16S rRNA高通量测序分析了灰飞虱Laodelphaxstriatellus体内细菌群落结构及多样性，结果表明灰飞虱雌雄成虫体内细菌种类一共有7门56属和73种。王天召等基于高通量测序法对褐飞虱Nilaparvatalugens肠道微生物多样性进行了研究，发现褐飞虱肠道内细菌共注释到7门15纲26目45科和73属，不动杆菌属Acinetobacter为优势属，其丰度为36.37%(王天召，2019)；李香香等通过16S rRNA测序对褐飞虱肠道细菌多样性进行分析，从褐飞虱室内种群肠道内鉴定得到13种细菌，其中以不动杆菌属、窄食单胞菌属、苍白杆菌属与TM7最为常见(李香香等，2011)。康小影等基于对细菌16S rRNA基因片段的序列分析，在白背飞虱体内-检测到11种细菌，隶属于γ-、α-、β-变形菌纲、拟杆菌纲、放线菌纲和芽孢杆菌纲。其中Wolbachia和Cardinium为细菌的主要种类，其次是成团泛菌Pantoeaagglomerans(康小影等，2014)。关于白背飞虱雌雄成虫肠道细菌的多样性，已有研究发现白背飞虱雌雄成虫肠道细菌共属于8属15种，其中芽孢杆菌属Bacillus为优势菌属(李香香，2010)。白背飞虱肠道细菌种类丰富，但白背飞虱雌雄虫体内分别有哪些可培养细菌，目前还不清楚，且云南元江县独特的干热河谷气候对白背飞虱肠道微生物组成是否有影响，目前尚不明确。

本研究以云南省元江县水稻田白背飞虱为材料，采用分离培养法研究白背飞虱雌雄成虫的肠道可培养细菌的组成，以期为元江县白背飞虱肠道细菌功能和雌雄虫肠道细菌组成差异及其机理研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 白背飞虱的田间采集

2019年6月，在云南省元江县(101°39′～102°22′ E，23°18′～23°55′ N)，未施用过农药的水稻田(水稻品种为元江地方品种)中，采用扫网法收集稻田白背飞虱成虫，并选择大小一致、健康活跃的成虫供试。

1.2 白背飞虱雌雄虫鉴别

背面观主要看腹部末端的形状，雌虫腹部末端尖锐，腹部中央纵沟内有一长形产卵器，雄虫腹部末端平秃，呈开口状，内藏外生殖器的各部构造，此外，一般雌虫的体形大于雄虫，雄虫的体色较雌虫为深(程遐年等，2003)。

1.3 白背飞虱肠道细菌的分离培养

1.3.1肠道解剖

将白背飞虱成虫装入尼龙网中再置于冰上使其昏迷，用75%酒精进行表面消毒两次，每次60 s，再全部浸泡在灭菌水中去除消毒液，将洗干净的成虫转入灭菌的解剖蜡盘上，取下飞虱头部，再用镊子夹住飞虱腹部末端，轻轻使劲将飞虱的全部肠道拉出，用灭菌水漂洗，去除卵巢、脂肪体和其他内脏器官，取出整个肠道置于 1.5 mL离心管中，并在离心管内加入0.5 mL 0.8%生理盐水，立即置于冰上(李香香，2010)。解剖时确保每个雌雄虫处理30头虫，并给每个处理都编号放在-80℃的冰箱中保存备用。

1.3.2培养基配制

细菌分离选用LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。其中LB培养基由胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉5 g，琼脂20 g，无菌去离子水1 L配制而成，再用4% NaOH溶液调节pH 7.0。牛肉膏蛋白胨培养基由牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，无菌去离子水1 L配制而成，再用4% NaOH溶液调pH 7.4～7.6。培养基配好后放在高温灭菌锅中121℃高温灭菌21 min(耿海荣等，2019)。

1.3.3匀浆与涂板

将解剖好的肠道加磷酸缓冲液后研磨至匀浆，充分摇匀后取10 μL连续稀释10倍，稀释3次得到原浓度的10-1、10-2和10-3，稀释后将每个浓度涂布在不同的培养基上，每个培养基涂布100 μL。涂布完成后写好标签，置于25±1℃的恒温培养箱中培养48 h，每天定时观察，并挑取不同形状、颜色、质地的单菌落置于LB培养基上继续纯化(Klassetal.，1999)，每个菌落纯化5次。

1.4 培养细菌形态及生化指标测定

1.4.1革兰氏反应

取一滴3%KOH溶液滴于载玻片中央，用接种环挑取待测菌落放在溶液中，用昆虫针轻轻搅动后将菌液向上提起，观察提起的时候有无粘丝。根据粘丝判断革兰氏阴性或阳性(李香香，2010)，其中有粘丝相连的为革兰氏阴性菌，记为“-”，无粘丝的是革兰氏阳性菌，记为“+”。

1.4.2过氧化氢酶反应

将纯化后的细菌单菌落挑取到新的LB液体培养基中，放在摇床上，30℃下培养48 h。取0.5 mL 3% H2O2溶液加入液体培养基中，若观察到大量的气泡，则为阳性记为“+”，没有气泡产生则为阴性记为“-”。

1.5 DNA提取及数据分析

采用冻融法提取DNA，分别在离心管中加入500 μL的无菌双蒸水，挑取已纯化的单菌落到离心管中，振匀后用液氮将离心管冷冻10 min，置于100℃水浴锅中水浴5 min，取出后涡旋30 s，12 000 r/min离心2 min，上清液可作为PCR模板。16S rRNA基因扩增选用细菌通用引物：27F:5′-AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3′和1429R:5′-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3′，反应体系为25 μL：两种引物各1 μL，模板DNA 1 μL，PCRmix 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL。反应条件：94℃热变性5 min，94℃变性1 min，53℃ 退火1 min，72℃延伸2 min，32个循环，72℃延伸10 min。PCR结束后取2 μL PCR产物进行凝胶电泳检测。鉴定好的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序(冯广达等，2013)。

运用Contigexpress 软件对测序结果进行拼接，将拼接好的16S rDNA序列提交到NCBI网站上，查找相似性最高的典型菌株并下载序列，运用MEGA 7.06软件，采用国际通用的邻接法(Neighbour-Joining)和Kimura双参数矫正模型构建系统发育树(郑亚强等，2017)。

2 结果与分析

2.1 白背飞虱肠道细菌人工培养特征及生化指标

从白背飞虱肠道分离出的30株菌，形状主要为圆形和不规则，颜色主要是黄色、淡黄色、淡橘色、白色，高度有凸起和扁平，边缘形状有光滑、不规则及出现透明圈3种，透明度主要是透明和半透明，湿度主要为湿润、半湿润和干燥，直径大小不一。革兰氏染色反应表明分离的菌株中有9株为革兰氏阴性菌，21株为革兰氏阳性菌；过氧化氢酶反应测定后发现，分离的30个菌株均呈阳性。

2.2 白背飞虱肠道细菌序列比对结果

白背飞虱雌、雄虫肠道细菌菌株测序后与NCBI数据库比对，其结果如表2。

表1 人工培养基培养特征及生化指标描述

续表1 Continued table 1

表2 分离菌株与NCBI数据库典型菌株的比对结果

续表1 Continued table 1

图1 基于16S rDNA序列的系统发育树分析Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

在培养基上分离培养获得的雌雄虫肠道细菌共30株，属于3门8科12属20种。其中，白背飞虱雌虫肠道细菌有16株，分属于3门8科8属12种，分别为厚壁菌门Firmicutes芽孢杆菌科Bacillaceae芽孢杆菌属Bacillus马氏芽孢杆菌Bacillusmarisflavi1株、炭疽芽孢杆菌Bacillusanthracis1株、环状芽孢杆菌Bacilluscirculans1株、葡萄球菌科Staphylococcidae葡萄球菌属Staphylococcus松鼠葡萄球菌Staphylococcussciuri4株、微小杆菌科Microbacteriidae微小杆菌属Exiguobacterium乙酰微小杆菌Exiguobacteriumacetylicum1株；变形菌门Proteobacteria莫拉氏菌科Moraxellaceae不动杆菌属Acinetobacter的Acinetobactersoli1株、欧文菌科Owenidae泛菌属Pantoea分散泛菌Pantoeadispersa1株、假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞菌属Pseudomonas的Pseudomonasotitidis2株、蒙氏假单胞杆菌Pseudomonasmosselii1株、布氏杆菌科Brucellae苍白杆菌属Ochrobactrum的Ochrobactrumpseudogrignonense1株；放线菌门Actinobacteria微杆菌科Microbacteriidae微杆菌属Microbacterium产左聚糖微杆菌Microbacteriumlaevaniformans1株、砖红色微杆菌Microbacteriumtestaceum1株。

从白背飞虱雄虫肠道中分离获得细菌14株，分属于3门8科10属12种，分别为厚壁菌门Firmicutes芽孢杆菌科Bacillaceae梭形杆菌属Lysinibacillus赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillusmacroides1株、假杆菌属Fictibacillu的Fictibacillusenclensis1株、芽孢杆菌属Bacillus地下芽孢杆菌Bacillussubterraneus1株、空气芽孢杆菌Bacillusaerius1株、烟酸芽孢杆菌Bacillusniacin1株、葡萄球菌科Staphylococcidae葡萄球菌属Staphylococcus松鼠葡萄球菌Staphylococcussciuri1株、微小杆菌科Microbacteriidae微小杆菌属Exiguobacterium乙酰微小杆菌Exiguobacteriumacetylicum1株；变形菌门Proteobacteria肠杆菌科Enterobacteriaceae肠杆菌属Enterobacter阿氏肠杆菌Enterobacterasburiae1株、莫拉氏菌科Moraxellaceae不动杆菌属Acinetobacter的Acinetobactersoli1株、假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞菌属Pseudomonas台湾假单胞菌Pseudomonastaiwanensis1株、黄单胞菌科Xanthomonadaceae寡养单胞菌属Stenotrophomonas嗜多养单胞菌Stenotrophomonaspavanii1株；放线菌门Actinobacteria微杆菌科Microbacteriidae微杆菌属Microbacterium产左聚糖微杆菌Microbacteriumlaevaniformans3株。

白背飞虱雌、雄成虫肠道中相同的细菌有4种，分别为厚壁菌门葡萄球菌科松鼠葡萄球菌、微小杆菌科微小杆菌属乙酰微小杆菌、放线菌门微杆菌科微杆菌属产左聚糖微杆菌、变形菌门莫拉氏菌科不动杆菌属Acinetobactersoli。

2.3 系统发育树分析

系统发育树分为3大支12个小支，厚壁菌门芽孢杆菌属的菌株XA1与它的模式菌株Bacillusniacinistrain聚为一类，NRX3和它的模式菌株Bacillussubterraneus聚为一类，CA1和它的模式菌株Bacilluscirculans聚为一类，这3小支又聚在一起合成一大支，表明这3种细菌的亲缘关系较近；NRC1与它的模式菌株Bacillusmarisflavi聚为一类，CL4与它的模式菌株Bacillusanthracis聚为一类，这2小支又单独聚成一大支，说明这两株的亲缘关系比较近；XA8与它的模式菌株Bacillusaerius单独聚为一类；葡萄球菌属的CA11、LCL1、NRX4、CA5、CA2与它们的模式菌株Staphylococcussciuri单独聚为一类；假杆菌属的NRX6与它的模式菌株Fictibacillusenclensis聚成一类；梭形杆菌属的NRX5与它的模式菌株Lysinibacillusmacroides聚成一类；微小杆菌属的菌株XA3与CA12和它们的模式菌株Exiguobacteriumacetylicum单独聚为一类。放线菌门微杆菌属的菌株CL5与它的模式菌株Microbacteriumtestaceum聚为一类，XA7、CL3、NRX2、XA6与它们的模式菌株Microbacteriumlaevaniformans聚为一类，这两小支又聚为一大支，说明这两个种亲缘关系较近。变形菌门苍白杆菌属的CL2与它的模式菌株Ochrobactrumpseudogrignonense单独聚为一类；寡养单胞菌属的XA5与它的模式菌株Stenotrophomonaspavanii单独聚为一类；泛菌属的CA4与它的模式菌株Pantoeadispersa聚为一类，肠杆菌属的XA2与它的模式菌株Enterobacterasburiae聚为一类，这两小支又聚为一大支，表明这两种细菌的亲缘关系较近；不动杆菌属的XA9、CA3与它们的模式菌株Acinetobactersoli单独聚为一类；假单胞菌属的CA7、CA10与它们的模式菌株Pseudomonasotitidis单独聚为一类；XA4与它的模式菌株Pseudomonastaiwanensis聚为一类，CA6与它的模式菌株Pseudomonasmosselii聚为一类，这两小支又聚为一大支，表明这两种细菌的亲缘关系较近。

2.4 白背飞虱肠道可培养细菌属种组成情况分析

从属水平上看，白背飞虱雌性成虫肠道中可培养的细菌有8个属，分别为葡萄球菌属、微小杆菌属、不动杆菌属、泛菌属、假单胞菌属、苍白杆菌属、微杆菌属、芽孢杆菌属。其中，葡萄球菌属相对多度为25%，是分离菌株中的优势菌属。雄性成虫肠中可培养的细菌有10个属，分别为葡萄球菌属、微小杆菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、直养单胞菌属、微杆菌属、梭形杆菌属、假杆菌属、芽孢杆菌属。其中，芽孢杆菌属和微杆菌属相对多度为22%，均是分离菌株中的优势菌属。

从种水平上看，白背飞虱雌性成虫肠道中可培养的细菌有12种，分别为：松鼠葡萄球菌、乙酰微小杆菌、Acinetobactersoli、分散泛菌、Pseudomonasotitidis、蒙氏假单胞杆菌、Ochrobactrumpseudogrignonense、产左聚糖微杆菌、砖红色微杆菌、马氏芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、环状芽孢杆菌。其中，松鼠葡萄球菌是分离菌株中的优势菌种，相对多度为25%。雄性成虫肠道中可培养的细菌有12种，分别为松鼠葡萄球菌、乙酰微小杆菌、阿氏肠杆菌、Acinetobactersoli、台湾假单胞杆菌、嗜多养假单胞杆菌、产左聚糖微杆菌、Fictibacillusenclensis、赖氨酸芽孢杆菌、地下芽孢杆菌、空气芽孢杆菌、烟酸芽孢杆菌。其中，产左聚糖微杆菌是分离菌株中的优势菌种，相对多度为22%。

图2 白背飞虱雌雄虫肠道可培养细菌在属水平上的组成情况Fig.2 Composition of culturable bacteria in the gut of female and male Sogatella furcifera at the genus level

图3 白背飞虱雌雄虫肠道可培养细菌在种水平上的组成情况Fig.3 Composition of culturable bacteria in the gut of female and male Sogatella furcifera at the species level

3 结论与讨论

对白背飞虱肠道细菌的研究已有一些报道，然而不同地区白背飞虱肠道内细菌组成不尽相同。康小影(2014)基于对细菌基因片段的克隆与序列分析，系统调查了采集于浙江富阳的白背飞虱体内细菌种类，从该地白背飞虱体内检测到11种细菌，隶属于γ-、α-、β-变形菌纲、拟杆菌纲、放线菌纲和芽孢杆菌纲，其中Wolbachia和Cardinium为细菌的主要种类，其次是成团泛菌Pantoeaagglomerans(康小影，2014)。李香香(2010)用LB培养基和NA培养基分离了采集于南京农业大学江浦农场的白背飞虱，发现该地白背飞虱雌雄虫肠道可培养细菌有8属15种，分别为金黄杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、放线菌属、短波单胞菌属、微杆菌属、不动杆菌属以及一株不可培养的微生物，其中芽孢杆菌属Bacillus为优势菌属(李香香，2010)。本研究利用LB培养基和NA培养基，对云南省元江县水稻田白背飞虱雌雄成虫肠道中分离获得3门12属20种细菌。从门水平看，共分离到厚壁菌门、变形菌门和放线菌门，而厚壁菌门为优势菌门，与王天召等报道的褐飞虱肠道微生物组成相似(王天召等，2019)；从属水平上看，云南元江水稻田白背虱肠道内细菌种类共有12个属，南京地区种群共有8个属，而本研究中雌雄虫肠道中的芽孢杆菌属、葡萄球菌属、微杆菌属、不动杆菌属等4个属和与此前报道相一致(李香香等，2010)，这可能与使用的分离培养基相同有关。

此外，本研究还发现白背飞虱雌雄虫肠道内均含有假单胞菌属和微小杆菌属。据报道，假单胞菌属细菌可降解苯酚、氯酚、多环芳烃、2, 4-D、甲苯、烷基磺酸盐和苯氧乙酸(栗旭阳等，2019)。微小杆菌属可以产生多种分泌酶，由于有些分泌酶在较宽的温度及酸碱条件下具有稳定性，因此微小杆菌己在环境修复、植物营养及发酵工业等方面有一些实际的应用(张莹等，2013)，而本研究的样品采集地元江县是典型的干热河谷气候，气温显著高于省内同纬度地区(陈宗瑜，2001)，微小杆菌属可能对白背飞虱能在本地生长繁殖具有重要作用。关于这两个菌属的相应功能，还需要进一步研究探讨。

同种昆虫不同性别其肠道内微生物多样性存在差异(魏晓莹等，2019)。家蚕雌雄个体肠道除了共有的优势菌属，雄性肠道中特有的优势菌属是Ralatonia、Methylobacterium和Staphylococcus；而雌性肠道中特有的优势菌属是Petrobacter、Clostridiumsensustricto(许刚等，2015)；研究发现灰飞虱雌雄成虫体内特有细菌分别为雌21种和雄32种(杨晓晴，2018)。本研究中，白背飞虱雌雄成虫肠道内细菌共同种类有4种，分别为松鼠葡萄球菌、乙酰微小杆菌、产左聚糖微杆菌和Acinetobactersoli。其中，雌成虫肠道优势菌属为葡萄球菌属，优势菌种为松鼠葡萄球菌；雄成虫肠道优势菌属为芽孢杆菌属和微杆菌属，优势菌种为产左聚糖微杆菌。有研究表明松鼠葡萄球菌产生的一种特殊的挥发性化学物质是重要的引诱剂和产卵刺激剂(Leroyetal.，2011)；产左聚糖微杆菌具有产生果糖的作用，能作为增稠剂和稳定剂，具有抗肿瘤和免疫刺激活性(Ohetal.，2004)。这两种菌对白背飞虱雌雄成虫的影响，还有待进一步的挖掘。