7种松树挥发物分析及其主要萜烯类物质对红脂大小蠹行为选择的影响

刘 敏，刘宇杰，付宁宁，徐 强，刘玉山，任利利，骆有庆

(北京林业大学，北京 100083)

红脂大小蠹DendroctonusvalensLeConte，又称强大小蠹，属鞘翅目Coleoptera小蠹科Scolytidae，原产于北美洲，传入我国后，对油松Pinustabuliformis造成严重危害，是一种重大的外来入侵生物。红脂大小蠹在北美洲原产地分布在北纬15°～55°，包括美国、加拿大和墨西哥、洪都拉斯和危地马拉(苗振旺等，2000；高宝嘉等，2003；Yanetal., 2005)。在原产地属于次期性害虫，主要侵害长势衰弱或被其他病虫害危害过的树木(潘杰等，2011)，受害针叶树包括松科的松属Pinus、云杉属Picea、黄杉属Pseudotsuga、冷杉属Abies和落叶松属Larix等35种以上的针叶树(赵建兴等，2008)。

目前，已知红脂大小蠹在我国的分布地区包括山西、陕西、河北、河南、北京等省(市)的大部分区域，以及甘肃、辽宁、内蒙古等省的个别县市(常宝山等，2001；苗振旺等，2001；刘满光等，2004；贾洪敏等，2008)。红脂大小蠹传入我国后转为初期性害虫，主要侵害胸径10 cm以上或树龄超过30年的健康油松(闫争亮等，2004；潘杰等，2011；Sunetal., 2013)。在山西还发现其危害白皮松Pinusbungeana，偶见侵害华山松PinusarmandiiFranch、云杉Piceameyeri、樟子松Pinussylvestrisvar.mongolica(张历燕等，2002；Yanetal.，2005；赵建兴，2006)，但因危害不严重未引起重视。2017年，在内蒙古赤峰市喀喇沁旗旺业甸林场40年生的樟子松与油松混交林内，我们发现樟子松受红脂大小蠹的严重危害，而油松受害相对较轻，红脂大小蠹优先选择樟子松。

红脂大小蠹在我国属高危险有害生物，分析该虫在新的分布地偏好为害寄主发生变化的原因及潜在的受害寄主，对于其防控具有重要意义。寄主挥发物在红脂大小蠹的行为选择中起重要作用，从树木中释放出来的挥发物可以为小蠹提供长距离和/或短距离的信息素，并且在某些情况下，可以协同小蠹的聚集信息素发挥作用(Erbilginetal., 2000；Miller and Borden, 2000; Chenetal., 2013)。Schlyter等提出了小蠹寄主选择依次经历栖境、寄主树种、寄主个体3个水平的抉择(Schlyter and Birgersson,1999)。而无论栖境抉择或树种抉择，红脂大小蠹都需要依靠寄主释放的萜烯类挥发物对寄主做出判断(段焰青等，2006；姚剑等，2011)。以往我国相关研究围绕油松展开，在新发生地其偏好寄主发生变化，寄主挥发物对红脂大小蠹的吸引作用是否也发生变化有待研究。本文选择我国7种主要的针叶树(包括油松、樟子松、华山松、白皮松、马尾松、红松、落叶松)展开试验。根据上述文献资料及我们前期调查红脂大小蠹在野外的危害情况，本文将7个树种划分为三类：(a)主要危害及偏好危害树种：油松、樟子松；(b)受害且未造成大面积死亡的树种：华山松、白皮松；(c)尚未发现受害的树种：马尾松、红松、落叶松。采集7种树种木段的挥发性物质进行分析，筛选其中主要萜烯类化合物进行红脂大小蠹的行为选择反应。以期明确寄主树种主要挥发性物质对新侵入地区内红脂大小蠹的吸引作用，为理解植物挥发物对红脂大小蠹寄主选择偏好的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试寄主树种

本试验中7个树种的采集地点详见表1。在不同的采集地点，选取胸径15 cm、长势较好的健康松树，伐倒后截为1 m长的木段，对木段两端进行封蜡保湿，装入防水密封包装袋中运输至内蒙古赤峰市黑里河林场。

表1 供试树种

1.2 供试虫源

试验所用的红脂大小蠹，均采自内蒙古赤峰市宁城县黑里河林场油松林，采集后通过是否可以听到其摩擦发声辨别雌雄(闫争亮等，2004; Liuetal., 2006)，分性别放置在养虫盒内，供给新鲜油松树皮韧皮部饲养。养虫盒存放于温度25℃、相对湿度55%、光周期为14 L ∶10 D的光照培养箱内，以备嗅觉行为研究。

1.3 树干挥发物的收集鉴定

采用动态顶空气体法收集7种寄主树种的树干挥发物，在待测松树木段距底端20～75 cm处采集。将树皮表面附属物清理干净，用聚乙烯食品级烘烤袋(406 mm×444 mm，Reynolds，Richmond，VA)包裹树干并做好密封，填充有Tenax TA (60/80 mesh，Supelco，Bellefonte，DE，USA)的钢制密封管作为吸附管，通过聚四氟乙烯(PVC)软管链接收集袋和吸附管。使用QC-1S大气采样仪(北京市劳动保护科学研究所)将袋内空气抽走，泵入活性炭过滤后的净化空气，气体流量为500 mL/min，密闭循环采气120 min。每种寄主树种随机采集3段重复。

在北京林业大学大型仪器中心，将采集好的吸附管经热脱附吹扫捕集-气相色谱-质谱联用仪(TCT-GC/MS，PE，CP 4020-Trace 2000/voyager；Perkin Elmer；Finnigan，ThermoQuest，San Jose，CA，USA)分析，色谱条件：毛细管柱Elite -5 ms，载气(He)流速2 mL/min，柱长30 m，内径0.32 mm，膜厚0.25 μm，采取两级程序升温方法，初始温度40℃保持2 min，第1级升温速率为6℃/min升至180℃保持0 min；第2级升温速率15℃/min，至270℃保持3 min，共用时34.33 min；质谱条件：溶剂延迟1 min，扫描质核比范围29～500 amu。采用TurboMass Ver 6.4.2软件，通过NIST2017谱图库检索，结合人工读图解析挥发物的组成成分。

1.4 红脂大小蠹对不同挥发物的行为选择

根据GC-MS分析结果并参考以往研究结果，选择相对含量较高的7种化合物作为刺激样品于室内进行红脂大小蠹的行为选择试验，以正己烷作为溶剂，将7种化合物单体分别稀释为3个浓度梯度: 10-4、10-2和1 mg/mL(张龙娃等，2009；张蕾蕾，2010)。试验所用化合物及纯度：(1R)-(+)-α-蒎烯(98%)，莰烯(90%)，(-)-β-蒎烯(94%)，月桂烯(90%)，(+)-3-蒈烯(95%)，(S)-(-)-柠檬烯(95%)，萜品油烯(85%)，以上样品均采购自Sigma试剂公司(美国)。

根据Ren等的方法，使用自制聚四氟乙烯双向十通道行为仪测定红脂大小蠹的行为选择反应(Renetal., 2017)。该行为仪具有10个平行的测道，每个测道的两个末端各插入一个200 μL的滤芯吸头，一端吸头内装有60 μL不同树种挥发物的正己烷溶液，另一端吸头内为60 μL正己烷作为对照。经过过滤的湿润空气经由QC-1S大气采样仪(北京市劳动保护科学研究所)以500 mL/min的流速进入行为选择仪的各个末端。通过尼康D810相机(日本)实时拍摄整个行为学测试存储为视频后，使用实时轨迹记录系统Etho vision XT 14.0(Noldus Information Technology, the Netherlands)识别并分析，统计30 min内每头成虫移动的总距离及在各区带停留的时间。行为仪中雌虫和雄虫各放入5头，在7种物质不同浓度条件下各测试1次为一组试验，每组试验完成后调换实验组和对照组的通气位置，共重复6组。

1.5 数据分析

通过总离子流峰面积归一化方法定量，计算挥发物的相对含量。使用Duncan检验分析挥发性物质含量与红脂大小蠹移动总距离的差异性，采用t检验分析红脂大小蠹在行为选择实验中在各区带的停留时间的差异性。所有数据采用SPSS Statistics 18.0(IBM，美国)进行统计分析，使用prism 8.0(Graphpad Software，美国)绘制图形。

2 结果与分析

2.1 7种植物的挥发性物质分析

通过GC-MS分析，从7种针叶树的挥发物气体样品中共检测出包含烯烃类、醇类、酮类、醛类、酯类、酸类、烷烃和芳香烃8类化合物在内的54种化合物。其中烯烃类化合物23种，在7个树种中相对含量均为最大(图1)。樟子松中共鉴定出35种化合物，烯烃类14种，相对百分含量为50.1%；油松中共鉴定出34种化合物，烯烃类13种，相对百分含量47.9%；马尾松中共鉴定出35种化合物，烯烃类16种，相对百分含量73.8%；白皮松中共鉴定出29种化合物，烯烃类13种，相对百分含量84.9%，华山松中共鉴定出24种化合物，烯烃类14种，相对百分含量85.3%；红松中共鉴定出37种化合物，烯烃类19种，相对百分含量为69.8%；落叶松共采集鉴定到化合物37种，烯烃类16种，相对百分含量38.9%。

图1 不同寄主树种8类挥发物相对含量Fig.1 Relative contents of eight types of volatiles in different tree species

利用平方欧式距离—组之间的链接法对7种树种的挥发物进行系统聚类分析，在距离>12并且<13处将其分为两个集群(A和B)；在距离>9并且<11处，可将A集群进一步分为A1和A2组(图2)。通过主成分分析将7种树种挥发物分为3组，与系统聚类分析结果一致，水平轴对总挥发物的解释率为33.7%，垂直轴的解释率为20.1%(图3)。a类主要受害树种樟子松和油松归为A1组，b类树种华山松、白皮松和c类未发现受害树种中的马尾松归为A2组，c类树种中的红松、落叶松归为B组。

图2 7种松树树干挥发物聚类分析图Fig.2 Cluster analysis of volatiles from the trunks of 7 tree species

图3 7种松树树干挥发物主成分分析得分图Fig.3 PCA score plot of volatiles from the trunks of 7 tree specie

A组5个树种挥发物的共同特征是含有高比例的α-蒎烯(22.73%±6.12%、26.55%±1.31%、53.62%±6.69%、16.89%±2.23%、11.36%±6.18%)，共有的萜烯类化合物包括莰烯、β-蒎烯、柠檬烯、萜品油烯。同时发现，A1组中α-蒎烯(22.73%±6.12%、26.55%±1.31%)及莰烯(2.49%±0.5%、3.17%±0.74%)的比例显著高于B组(8.86%±1.07%、9.41%±2.56%)和(0、1.32%±0.52%)(P<0.05)。除此之外，A1组两树种中共有的萜烯类化合物还包括(+)-3-蒈烯，A2组包括月桂烯。以上数据见表2。故选择上述7种化合物：(1R)-(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯，月桂烯，(+)-3-蒈烯，(S)-(-)-柠檬烯、萜品油烯、莰烯进行红脂大小蠹的行为反应(α-蒎烯、β-蒎烯和柠檬烯的构型参考以往研究结果选择(王鸿斌等，2006；张龙娃等，2009；陈海波，2010；陈大风等，2013)。

2.2 行为选择偏好性分析

2.2.1红脂大小蠹在不同物质不同浓度刺激下的移动距离

在30 min内，红脂大小蠹在不同浓度7种化合物刺激下的总移动距离如表3所示。随着月桂烯(A2组特征性挥发物)浓度的升高，红脂大小蠹雌虫的移动距离呈显著下降趋势(P<0.05)；在相同浓度的月桂烯刺激下，红脂大小蠹雌雄成虫的移动距离存在差异，在10-4mg/mL的月桂烯刺激下，雌虫移动距离显著高于雄虫(P<0.05)，而在1 mg/mL的月桂烯刺激下，雌虫移动距离显著低于雄虫(P<0.05)。另外，在10-2mg/mL的莰烯刺激下，雌雄成虫的移动距离均显著高于其余对照组(P<0.05)，在10-4mg/mL的莰烯刺激下，雄虫的移动距离显著低于雌虫(P<0.05)。其他化合物对红脂大小蠹总移动距离的影响不显著。

表3 红脂大小蠹在不同物质不同浓度刺激下30 min内的移动距离(cm)

2.2.2红脂大小蠹在不同区带内停留的平均时间

在不同浓度各化合物的刺激下，试验记录开始后30 min内，红脂大小蠹在不同区带的停留时间如图4所示。雌虫在10-2mg/mL的(+)-3-蒈烯(t=5.264，P<0.001)，l mg/mL的月桂烯(t=3.796，P<0.005)，1 mg/mL (-)-β-蒎烯(t=3.347，P<0.005)区带的停留时间显著高于对照正己烷组，雄虫在10-4mg/mL的(S)-(-)-柠檬烯区带内停留时间显著高于对照组(t=3.853，P<0.005)。其中(-)-β-蒎烯与(S)-(-)-柠檬烯为A组树种共有的化合物，(+)-3-蒈烯为A1组树种的特征性挥发物，月桂烯为A2组树种的特征性挥发物。其他对照条件下没有显著差异。

3 结论与讨论

本实验中7种松树挥发物中，α-蒎烯，β-蒎烯，月桂烯，(+)-3-蒈烯， (-)-柠檬烯为主要挥发性成分，与北美红脂大小蠹的主要寄主黄松的松脂主要成分相符(Hobsonetal.，1993)。松树的挥发性物质聚类分析与主成分分析结果与目前野外受害情况基本一致，已发现受害的树种与未发现受害的树种挥发物分为两组。除马尾松外，A组树种为目前已发现受害的a类和b类树种，B组为野外未发现受害树种。且A组5个树种挥发物的共同特征是含有高比例的α-蒎烯(22.73%±6.12%、26.55%±1.31%、53.62%±6.69%、16.89%±2.23%、11.36%±6.18%)，共有的萜烯类化合物包括莰烯、β-蒎烯、柠檬烯、萜品油烯。通过对比A1组与A2组，发现A1组中特有的萜烯类挥发物为(+)-3-蒈烯，A2组特有的萜烯类挥发物为月桂烯，且A1组莰烯(2.49%±0.5%、3.17%±0.74%)的比例高于A2(0.84%±0.1%、0.43%±0.05%、0.15%±0.12%)组。从以上结果推测，树种挥发性物质的组成、含量等影响红脂大小蠹的偏好寄主选择。

Hobson等在美国的研究认为β-蒎烯对红脂大小蠹的引诱能力最强(Hobsonetal.，1993)，Sun等在中国的研究发现，3-蒈烯对红脂大小蠹引诱能力最强，柠檬烯具有抑制引诱的作用 (Sunetal., 2004)。本文中β-蒎烯、柠檬烯为A组树种共有的挥发物，(+)-3-蒈烯为A1组树种特有挥发性物质。与以往研究不同，本研究中1 mg/mL (-)-β-蒎烯与10-2mg/mL (+)-3-蒈烯对雌性红脂大小蠹均有明显的吸引作用，(S)-(-)-柠檬烯对红脂大小蠹雄虫也有吸引作用。停留时间在本试验中被选择作为评价其行为选择的主要指标。统计结果表明，雌虫在10-2mg/mL的(+)-3-蒈烯(t=5.264，P<0.001)以及1 mg/mL (-)-β-蒎烯(t=3.347，P<0.005)区带的停留时间均显著高于对照正己烷组，表明上述两种刺激对红脂大小蠹雌虫具有显著的吸引作用。雄虫在10-4mg/mL的(S)-(-)-柠檬烯(t=3.853，P<0.005)区带内停留时间显著高于对照组，且王鸿斌等证明雄性红脂大小蠹对柠檬烯的触角电位反应值与对照之间的差异达到了显著性的水平(王洪斌等，2006)，这一结果说明该浓度下(S)-(-)-柠檬烯对红脂大小蠹雄虫具有吸引作用。由于红脂大小蠹在北美原产地就存在对萜烯类化合物反应的地理差异(Sunetal.，2004；张龙娃，2007)，推测上述结果差异可能与红脂大小蠹对寄主挥发性萜烯类物质的反应出现新的地理变异有关；或由于本研究在室内进行，而以往研究为野外试验，结果差异与不同温度条件下挥发物的释放速率有关。

本研究中发现莰烯与月桂烯对红脂大小蠹的行为具有刺激作用。移动距离的结果显示，雌虫在10-4mg/mL月桂烯刺激下以及雌雄成虫在10-2mg/mL莰烯刺激下活动较为活跃。停留时间的统计结果显示，雌虫在l mg/mL的月桂烯(t=3.796，P<0.005)区带的停留时间显著高于对照正己烷组。莰烯为A组树种共有的萜烯类挥发物，且A1组莰烯(2.49%±0.5%、3.17%±0.74%)的比例高于A2组(0.84%±0.1%、0.43%±0.05%、0.15%±0.12%)；月桂烯为A2组特有的萜烯类挥发物。

值得注意的是，马尾松与已发现受害的4个寄主树种挥发物较为相似，且与a类树种樟子松、油松同属二针松，但在自然条件下未见其被危害的报道；需要进一步了解红脂大小蠹的寄主选择机制，除了寄主植物挥发性物质的影响以外，需综合考虑当地气候、温湿度，树皮厚度、营养物质、含水量、渗透压以及流脂等情况，展开进一步的研究。

本文研究了我国几种主要松树树干挥发物的组成及含量。通过主成分分析和聚类分析明确了7种树种挥发物的差异性，并与红脂大小蠹的野外危害情况类比分析，筛选出可能与红脂大小蠹寄主选择行为相关的萜烯类挥发物进行行为选择试验。研究发现红脂大小蠹的主要寄主树种油松和新发现的优势危害树种樟子松的挥发性物质高度相似，且其中的主要挥发性萜烯化合物β-蒎烯、柠檬烯、(+)-3-蒈烯对红脂大小蠹具有吸引作用，莰烯与月桂烯对红脂大小蠹也有明显的刺激作用。本研究加强了红脂大小蠹趋性行为与寄主树种挥发性代谢物质相互关系的研究，有助于红脂大小蠹引诱剂和驱避剂的开发，同时进一步阐明其寄主选择机制，为红脂大小蠹监测与控制技术体系提供重要依据。

致谢:感谢内蒙古赤峰市黑里河林场对本研究的大力支持，为我们提供了试虫和部分试验场所。