重症肌无力患者外周血PD-1和IL-23水平及其与AChR-Ab、病情严重程度相关性

袁慧姣，韩 波

重症肌无力是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，特征是血中出现针对神经肌接头不同成分的抗体，85%的重症肌无力患者存在乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptor antibodies,AChR-Ab)，以肌无力为主要临床表现，具有晨轻暮重、休息或使用胆碱酯酶抑制剂后减轻的特点[1-2]。虽然目前临床对重症肌无力的研究已相当深入，能够根据不同自身抗体对其进行分型，但其具体病理生理机制仍未完全阐明[3]。近年有研究报道白细胞介素-23(interleukin-23， IL-23)是辅助性T淋巴细胞17(Th17)的重要刺激分子，而后者在重症肌无力的发病中发挥关键作用[4]。与此同时，越来越多的学者指出程序性死亡受体-1(programmed death receptor-1， PD-1)会引发重症肌无力症状[5]。提示PD-1及 IL-23可能参与了重症肌无力的发病机制。因此，本研究探讨重症肌无力患者外周血中PD-1和IL-23的水平及其与AChR-Ab、病情严重程度相关性，以期为其在重症肌无力病理生理机制中发挥的作用提供线索。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年12月—2019年12月在辽宁中医药大学附属医院就诊的符合纳入及排除标准的重症肌无力44例作为重症肌无力组，其中男21例，女23例；年龄31～55(44.2±12.5)岁。另选取同期在该院进行体检的健康体检者44例作为健康体检组，其中男20例，女24例；年龄28～52(41.6±11.4)岁。两组性别及年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准同意执行。

1.2纳入及排除标准 纳入标准：①年龄>18岁；②符合重症肌无力诊断治疗标准，表现为典型重症肌无力症状，新斯的明试验阳性且低频重复神经电刺激波幅递减10%以上[6]；③未接受胆碱酯酶抑制剂或免疫抑制剂治疗；④患者和(或)其家属签署相关知情同意书。排除标准：①其他原因引起的眼肌麻痹患者；②Guillain-Barra综合征患者；③慢性获得性脱髓鞘性多发性神经病患者；④多发性肌炎患者；⑤Lambert-Eaton综合征患者；⑥代谢性疾病如甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退症和糖尿病等引起的眼肌麻痹或外周神经病变患者；⑦恶性肿瘤患者；⑧严重脏器功能不全患者；⑨其他自身免疫性疾病患者；⑩怀孕或哺乳期妇女。

1.3材料及方法

1.3.1血样采集：所有入选者均于晨起空腹时采集静脉血2份至含有乙二胺四乙酸的真空管中，其中1份(4 ml)于4℃静置并3000 r/ min 离心10 min,取上清液存于-80℃冰箱冻存备用；另1份(6 ml)用于外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMCs)的分离。

1.3.2流式细胞术检测PBMCs中PD-1水平：在血样中按1∶1的体积比加入磷酸盐缓冲盐(PBS) 稀释混匀，加入装有6 ml淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)的离心管中2000 r/min 离心20 min，分离PBMCs层转移至新离心管并加入 PBS 混匀，2000 r/min离心10 min，洗涤 2 次后重悬细胞，后加入抗人PD-1抗体(中国abcam公司生产)进行染色，洗涤细胞并加入4%多聚甲醛(上海生工生物科技有限公司生产)固定，随后采用MACSQuantTM流式细胞仪(中国美天旎生物技术公司生产)检测PD-1阳性细胞比例。

1.3.3酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清IL-23及AChR-Ab水平：采用人血清IL-23(美国Thermo Fisher Science公司生产)、AChR-Ab(南京森贝伽生物科技有限公司生产)ELISA检测试剂盒及MultiskanTMFC酶标仪(美国Thermo Fisher Science公司生产)检测血清IL-23及AChR-Ab水平，每个样品重复3次试验取其平均值。

1.3.4患者病情严重程度评估：采用重症肌无力定量(quantitative myasthenia gravis， QMG)评分评估重症肌无力组病情严重程度，QMG评分包括复视、上睑下垂、面肌、吞咽功能、构音障碍、颈肌、双侧臂力、肺活量、双侧握力和双侧腿肌13个项目，涉及眼、延髓、呼吸、颈和四肢5个方面的评估，每个项目0～3分，由低到高代表功能依次减退，总分0～39分[7]。

2 结果

2.1重症肌无力组和健康体检组外周血PD-1与 IL-23比较 外周血中PD-1与IL-23，重症肌无力组分别为(18.07±5.54)%和(29.51±4.81)pg/ml，高于健康体检组(10.67±2.50)%和(20.44±5.15)pg/ml，差异有统计学意义(t=8.482，P<0.001;t=8.083,P<0.001)，见图1。

2.2外周血PD-1和 IL-23对重症肌无力的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，外周血PD-1和IL-23诊断重症肌无力的AUC分别为0.887(95%CI:0.816,0.959;P<0.001)和0.890(95%CI:0.825,0.955;P<0.001),见图2。外周血PD-1和IL-23诊断重症肌无力的最佳截断值分别为15.07%和24.44 pg/ml；在最佳截断值下，外周血PD-1诊断重症肌无力的特异度、敏感度、准确率和一致率分别为95.5%、72.7%、68.2%、84.1%，外周血IL-23诊断重症肌无力的特异度、敏感度、准确率和一致率分别为79.6%、84.1%、64.6%、81.8%。

2.3重症肌无力患者外周血PD-1和 IL-23与AChR-Ab的相关性分析 重症肌无力44例AChR-Ab为(1.29±0.33)nmol/L。Pearson相关性分析结果显示，重症肌无力患者外周血PD-1和 IL-23与AChR-Ab均呈正相关，r分别为0.735(P<0.001)和0.725(P<0.001),见图3。

2.4重症肌无力患者外周血PD-1和 IL-23与QMG评分的相关性分析 重症肌无力44例QMG评分为(5.35±1.48)分。Pearson相关性分析结果显示，重症肌无力患者外周血PD-1和 IL-23与QMG评分均呈正相关，r分别为0.695(P<0.001)和0.693(P<0.001)。见图4。

3 讨论

重症肌无力是影响神经肌肉接头的主要疾病，年发病率为(8～10)/100万，患病率为(150～250)/100万，发病机制涉及细胞免疫和补体，且有多种自身抗体参与[8-12]。既往研究报道多种分子参与重症肌无力的发生和发展，并且根据不同自身抗体表达可将其分为不同亚型[13]。但由于重症肌无力发病机制现仍未完全阐明，部分患者治疗效果欠佳或易复发，进一步探讨其相关细胞因子及表面抗体有助于开发新的诊断治疗靶点。

本研究结果显示，外周血中PD-1与IL-23，重症肌无力组分别为(18.07±5.54)%和(29.51±4.81)pg/ml，高于健康体检组(10.67±2.50)%和(20.44±5.15)pg/ml，差异有统计学意义。IL-23是Th17分泌的重要细胞因子，可通过维甲酸受体相关孤儿受体激活IL-17信号通路，并且可通过Jak2/tyk2-STAT3和核因子(NF)-κB 信号通路产生其他促炎性细胞因子和趋化因子[14]。现临床针对IL-23的单抗已被用于多种自身免疫性疾病如银屑病、类风湿性关节炎和炎症性肠病等的治疗[15]。PD-1是一种抑制性受体，属于CD28/CTLA-4家族，通过结合程序性死亡配体(PD-L)1和PD-L2提供抑制信号维持T细胞激活、耐受和免疫介导组织损伤之间的平衡[16]。目前，越来越多的研究表明PD-1和PD-L1通路在自身免疫性疾病如自身免疫性肝炎和系统性红斑狼疮中发挥重要的作用[17-18]，但是关于PD-1及 IL-23在重症肌无力患者外周血中水平的研究却十分有限。

本研究明确了PD-1和 IL-23在重症肌无力患者外周血中升高后，进一步探讨外周血PD-1和 IL-23对重症肌无力的诊断价值，结果显示外周血PD-1和IL-23诊断重症肌无力的AUC分别为0.887和0.890,均接近0.9，具有较好的诊断价值;最佳截断值分别为15.07%和24.44 pg/ml。王彩琴等[19]的研究结果显示，重症肌无力患者外周血淋巴细胞PD-1阳性率为20%，高于健康对照者，本研究结果与其结论基本相符。本研究结果显示，外周血PD-1和IL-23最佳截断值下诊断重症肌无力的特异度、敏感度、准确率和一致率分别为95.5%、72.7%、68.2%、84.1%和79.6%、84.1%、64.6%、81.8%。说明外周血 PD-1诊断重症肌无力的准确率及一致率均高于IL-23，可见其整体诊断价值高于IL-23，且其诊断特异度高达95.5%；而IL-23诊断重症肌无力的敏感度高于PD-1。提示IL-23适用于对可疑重症肌无力人群的初步筛查，而PD-1则适用于对重症肌无力患者的确诊。

AChR-Ab在重症肌无力患者中有85%的阳性率，是重症肌无力发病的重要介质，也是诊断重症肌无力的重要参考指标[6]。因此，本研究进一步探讨了重症肌无力患者外周血PD-1和 IL-23与AChR-Ab的相关性，结果显示重症肌无力患者外周血PD-1和 IL-23与AChR-Ab均呈正相关，r分别为0.735和0.725，均在0.7以上，说明外周血PD-1和 IL-2与重症肌无力主要致病抗体AChR-Ab有较好符合度。最后，本研究为探讨外周血IL-23和PD-1与重症肌无力病情严重程度之间的相关性，采用QMG评分对患者病情严重程度进行了量化，分析外周血PD-1和IL-23与QMG评分的相关性,结果显示重症肌无力患者外周血PD-1和 IL-23与QMG评分呈正相关，r分别为0.695和0.693。QMG评分由美国重症肌无力协会提出后被广泛用于重症肌无力患者的病情评估及治疗方法效果评估，具有较好预后预测价值[20-21]。本研究结果说明外周血IL-23和PD-1与QMG评分具有中度相关性，对重症肌无力患者病情严重程度及治疗效果判断具有一定价值。

本研究也存在一定不足之处，首先，由于受医院医疗规模所限，样本量稍显不足，后续研究将以本研究作为参考计算样本量并予以扩充，必要时增设多中心研究以进一步验证结论；其次，本研究采用流式细胞术及ELISA作为血液指标的检测方法，后续研究可采用其他方法如放射免疫法和免疫印迹试验等对指标进行多种技术的相互验证以提高检测的准确性；最后，本研究只纳入了AChR-Ab作为验证外周血PD-1和 IL-23的自身抗体指标，后续可纳入其他抗体如MuSK抗体和LRP4抗体等验证外周血PD-1和 IL-23对其他重症肌无力亚型的诊断价值。

综上所述，重症肌无力患者外周血IL-23和PD-1高于健康体检者；外周血IL-23和PD-1对重症肌无力有较好的诊断价值，且其与AChR-Ab、病情严重程度呈正相关。