身痛逐瘀汤抗骨关节炎网络药理学研究

吴范武 邵 帅 李继安 吴晨曦 杨雨旸

华北理工大学中医学院 河北唐山 063210；①河北省中西医结合防治糖尿病及其并发症重点实验室

身痛逐瘀汤出自《医林改错》，方中桃仁、当归、红花、牛膝、川芎、没药、香附活血化瘀，地龙、五灵脂通络止痛，羌活、秦艽祛邪利湿，甘草调和诸药[1]。王清任认为 “气血通活，何患疾病不除”“所伤者无非气血”。基于此，现代许多研究应用身痛逐瘀汤以活血祛瘀、通痹止痛，李继超等[2]发现身痛逐瘀汤治疗痰瘀互结型膝骨关节炎疗效确切；钟文龙等[3]发现身痛逐瘀汤能缓解膝骨关节炎疼痛；孙壮等[4]发现身痛逐瘀汤可有效改善瘀血闭阻型膝骨性关节炎；向益[5]发现身痛逐瘀汤治疗瘀血闭阻型膝骨关节炎疗效佳；陈国华[6]发现身痛逐瘀汤能更有效改善关节活动的受限。以上均可说明身痛逐瘀汤对骨关节炎有较好疗效，但其作用机制尚不明确。

目前，网络药理学对中药复方的研究日趋成熟。它的研究模式并不是对药物的简单累加，而是以药物间协同作用为基础的整合，符合中医整体性与辨证论治的原则。本研究通过网络药理学的方法对身痛逐瘀汤抗骨关节炎的作用机制进行探讨。

1 方法

1.1有效活性分子的筛选 通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)[7-8]，收集身痛逐瘀汤各组成药物的成分信息。依据口服生物利用度(OB≥30%)、类药物参数(DL≥0.18)和半衰期(HL≥4)三个关键指标进一步筛选[9-11]，同时查阅文献作为补充，最终获得身痛逐瘀汤的有效活性成分。

1.2药物潜在靶点的预测 结合PubChem、CancerHSP和DrugBank[12-13]等数据库，将活性成分对应的靶点在UniProt数据库中进行校正，转换为基因名。

1.3骨关节炎靶点的筛选 利用GeneCards、OMIM和Therapeutic Target Database (TTD) 数据库，以“osteoarthritis”为关键词查找骨关节炎的相关靶点。

1.4骨关节炎相关的药物活性成分靶点 利用R语言的VennDiagram包，将身痛逐瘀汤活性成分的预测靶点同骨关节炎相关靶点进行对比、取交集，获得身痛逐瘀汤抗骨关节炎的预测作用靶点，绘制韦恩图。

1.5分子-靶点网络的构建 将身痛逐瘀汤有效活性成分和预测的其抗骨关节炎靶点导入Cytoscape 3.8.0，构建成分-靶点网络，分析属性[14-15]，筛选出身痛逐瘀汤抗骨关节炎的主要活性成分及关键作用靶点。

1.6蛋白-蛋白互作网络(PPI)的构建 将身痛逐瘀汤抗骨关节炎的预测作用靶点导入STRING 11.0的“Multiple proteins”功能中，物种(Organism)设为“Homo sapiens”，最小互作得分(Interaction Score)设为“Medium Confidence-0.900”，其余参数保持默认设置，构建PPI网络，保存结果。

1.7基因本体和信号通路分析 基于R语言，借助Bioconductor的ClusterProfiler、DOSE和Pathview语言包，对身痛逐瘀汤抗骨关节炎作用靶点进行GO和KEGG通路富集分析，预测作用靶点涉及的主要生物过程和信号通路(P<0.05)，筛选排名前20的生物过程和信号通路，绘制条形图和气泡图。

2 结果

2.1身痛逐瘀汤活性成分筛选 TCMSP等数据库中共检索到身痛逐瘀汤的1641个活性分子，按OB≥30%、DL≥0.18和 HL≥4的要求，筛选得到207个有效活性分子，去重后最终得到180个活性成分。

2.2身痛逐瘀汤治疗骨关节炎相关靶点预测 通过TCMSP、PubChem、CancerHS、DrugBank等数据库，寻找上述180个活性成分的潜在靶点，剔除重复后，利用Uniprot数据库进行标准化匹配校正，最终获得462个药物靶点。在GeneCards、OMIM和TTD数据库中，以“osteoarthritis”为关键词查找，共获得骨关节炎的相关靶点2885个。将药物的相关靶点与疾病的相关靶点取交集，得到186个预测靶点，见表1；将结果绘制韦恩图，见图1。

表1 身痛逐瘀汤抗骨关节炎潜在作用靶标信息列表

图1 药物与疾病交集靶点韦恩图

2.3活性成分-靶点网络构建 应用Cytoscape 3.8.0软件将180个活性成分与186个预测靶点进行关联，构建成分-靶点网络，见图2。其中47个活性成分因无对应的靶标被剔除，最终网络共包括133个成分节点、186个靶点节点及1096条相互作用连线。

图2 分子-靶点网络

分析显示，该网络节点的平均度值(Degree)为6.91，平均介数中心性(Betweenness Centrality)为0.01。选取度值和介数中心性均超过平均值的节点为核心节点，包括quercetin/槲皮素、kaempferol/山柰酚、beta-sitosterol/β-谷甾醇、luteolin/木犀草素、baicalein/黄芩素等19种主要活性成分，见表2；ESR1、AR、PTGS1、PPARG、GSK3B等10个关键作用靶点，见表3。

表2 网络核心活性成分信息

表3 网络核心靶点基因名称及拓扑学性质

2.4PPI网络构建 将186个交集靶点导入STRING 11.0，分析蛋白互作关系，绘制PPI网络图，见图3。筛选PPI网络中连线数目前20的靶点，绘制条形图，见图4。

2.5GO和KEGG富集分析 GO分析得到150个条目(P<0.05)，主要涉及核受体活性、转录因子活性、受体配体活性、类固醇结合、类固醇激素受体等，见图5。KEGG 通路富集分析筛选得到137条信号通路(P<0.05)，主要涉及MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-kB信号通路、JAK-STAT信号通路、Toll样受体信号通路等，见图6。MAPK信号通路见图7。

图3 PPI网络

图4 PPI网络中30个连线数目最多的蛋白质

图5 GO功能富集分析条形图与气泡图

图6 KEGG通路富集分析条形图与气泡图

图7 MAPK信号通路

3 讨论

身痛逐瘀汤抗骨关节炎的分子-靶点网络主要有效分子涉及quercetin/槲皮素、kaempferol/山柰酚、beta-sitosterol/β-谷甾醇、luteolin/木犀草素、baicalein/黄芩素等。quercetin/槲皮素能降低炎症因子的表达，保护关节软骨[16]；kaempferol/山柰酚可减轻关节软骨病变，缓解炎性反应和神经根疼痛[17]；beta-sitosterol/β-谷甾醇能加强成骨作用[18]；Luteolin/木犀草素可促进前成骨细胞增殖、分化和矿化等[19]；baicalein/黄芩素能抑制破骨细胞分化[20]。

身痛逐瘀汤抗骨关节炎的186个预测靶点，可推测出152个GO条目(P<0.05)，涉及核受体活性、转录因子活性、受体配体活性、类固醇结合、类固醇激素受体等。核受体调控多种生物学过程，其功能紊乱可导致炎症[21]。转录因子参与炎症与免疫反应，与骨关节炎发病、治疗相关[22]。受体配体解释了生理和病理过程[23]。类固醇激素在治疗骨关节炎中也有很大作用。

KEGG通路富集筛选到137条信号通路(P<0.05)，MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-kB信号通路、JAK-STAT信号通路、Toll样受体信号通路等明显与骨关节炎相关。MAPK信号通路与骨关节炎病理改变有关[24]；激活PI3K/Akt信号通路可抗骨关节炎[25]；NF-kB信号通路与骨关节炎的发生、发展有关[26]；JAK/STAT信号通路在骨关节炎病理变化中发挥作用[27]；Toll样受体引起的固有免疫是骨关节炎的重要环节[28]。

因此，身痛逐瘀汤主要通过quercetin/槲皮素、kaempferol/山柰酚、beta-sitosterol/β-谷甾醇、luteolin/木犀草素、baicalein/黄芩素等分子作用于ESR1、AR、PTGS1、PPARG、GSK3B等靶点，进而影响核受体活性、转录因子活性、受体配体活性、类固醇结合、类固醇激素受体等，调节MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-kB信号通路、JAK-STAT信号通路、Toll样受体信号通路等以抗骨关节炎。

综上，身痛逐瘀汤抗骨关节炎是通过多成分、多靶点、多通路的协同作用来实现的。