弓形虫弱毒疫苗的研究进展

张海生，马元元，谢世臣，梁勤立，朱兴全，王金磊

刚地弓形虫简称弓形虫，是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫，可感染包括人在内的几乎所有温血动物；全世界约有30%的人感染，我国人群感染率约为5%～20%[1-2]。弓形虫病给畜牧业造成严重经济损失，使人类健康受到严重威胁。由于弓形虫生活史复杂、宿主广泛、发育时期多且各发育期抗原成分特异性显著，致病、免疫机制复杂，至今无有效的抗弓形虫病药物和理想的防治方法。人类感染弓形虫的主要途径是通过食源性感染，如食用加工不熟的肉类和不干净的果蔬等，弓形虫包括不同基因型的虫株，例如传统的Ⅰ型(ToxoDB#10)、II型(ToxoDB#1)和III型(ToxoDB#2)虫株[3-5]。由于弓形虫广泛的宿主范围以及在动物和人群导致的高感染率，疫苗免疫是预防人和动物弓形虫病的重要策略。虽然科研人员研究了针对弓形虫的多种传统疫苗，例如灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗等，但是各有其缺陷，对动物的免疫保护力不强。目前效果最好的是弱毒疫苗，例如自然或人为筛选的S48、T263、TS-4等，其中S48已制成弓形虫Toxovax 疫苗[6-8]。用传统基因编辑技术已构建多株弱毒虫株，具有较好的免疫保护作用。通过CRISPR-Cas9在弓形虫研究中的成功应用，已构建了多株具有良好免疫保护作用的弱毒疫苗。本文综述弓形虫弱毒疫苗的研究进展和发展前景，旨在为弓形虫疫苗的后续研究提供参考。

1 弓形虫传统弱毒疫苗

TS-4虫株是由弓形虫RH株通过化学突变后获得，该虫株可有效防止组织包囊的形成，可部分预防先天性弓形虫感染并提高急性感染的存活率[11]。TS-4虫株虽在猪模型中以及在免疫力强的灵长类动物体内安全使用，可作为很有希望的疫苗株，但它的安全性有待进一步评价。

弓形虫T263虫株由自然突变而来，给猫接种T263虫株速殖子后，当弓形虫感染猫时，可成功阻止84%的猫排出卵囊[11-13]。但由于该虫株不能完全阻止猫卵囊的排出，以及考虑到安全性问题，该疫苗株并未商业化[11-12]。

2 弓形虫传统基因编辑疫苗

弓形虫传统基因编辑疫苗是通过传统基因编辑技术如锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技术等构建弓形虫基因敲除株，成为弱毒疫苗株，例如RHΔMIC1-3、PruΔOMPDC、RHΔCPS1-1等。RHΔMIC1-3是弓形虫Ⅰ型RH株的MIC1和MIC3基因双敲除后所构建的弱毒株，MIC1可形成弓形虫粘附所需的结构域，该结构域可特异性结合乳糖；MIC3则形成表皮生长因子样结构域和1个凝集素样结构域[14-16]。弓形虫的MIC1和MIC3这两个基因同时敲除之后不仅影响弓形虫的粘附和入侵，还影响弓形虫的毒力[14]。如果单独敲除MIC1或MIC3基因则对弓形虫毒力只是微弱的减弱，当对MIC1和MIC3基因双敲除时弓形虫的毒力明显降低[15]。RHΔMIC1-3在小鼠体内对先天性弓形虫感染具有很强的保护作用，且可有效阻断弓形虫的垂直传播，诱导小鼠产生有效免疫应答[15]。除小鼠外，RHΔMIC1-3还可使绵羊产生有效持久的免疫保护力，免疫接种怀孕绵羊时虽然具有轻微的发热现象但是不具有感染性；用105个RHΔMIC1-3速殖子接种雌性绵羊可以有效防止绵羊流产，并且减少母羊所产羔羊组织包囊的数量[10]。有趣的是，RHΔMIC1-3接种猫后并不会在猫体内繁殖，它可使猫体内产生抗体，但该抗体并不能阻止野生株在猫体内的繁殖，这表示RHΔMIC1-3具有宿主特异性[16]。

尿嘧啶是弓形虫繁殖和毒力形成所必需的，弓形虫具有完整从头合成尿嘧啶的途径[17-18]。脱羧酶(OMPDC)和氨甲酰磷酸合成酶II(CPSII)是弓形虫从头合成尿嘧啶途径中的关键调节酶，这两种酶由OMPDC基因和CPS基因所决定[17-19]。敲除OMPDC基因或CPS基因均会形成尿嘧啶缺陷型虫株。PruΔOMPDC是在弓形虫II型Pru虫株上敲除OMPDC基因所得到的毒力完全减弱的不可逆虫株。OMPDC基因的敲除使虫株繁殖能力丧失、毒力完全减弱、丧失形成包囊和慢性感染的能力[18]。PruΔOMPDC可有效诱导机体产生强烈的体液免疫应答，细胞因子CD8+的含量明显急剧增加，接种小鼠后可预防弓形虫I型和II型虫株的急性感染，并可大幅度降低II虫株感染后形成包囊的能力[19]。

RHΔCPS1-1虫株也是由弓形虫强毒株RH改造构建而成的，接种RHΔCPS1-1速殖子可诱导小鼠产生长期的保护性免疫力，能有效防止弓形虫RH株的感染[20]。RHΔCPS1-1虫株还可有效延长被弓形虫慢性感染小鼠的存活时间，提高弓形虫急性感染的小鼠的存活率，还可减少组织包囊的数量并阻止弓形虫向脑内移行[21-22]。

3 CRISPR-Cas9基因编辑疫苗

2014年Shen B等人首次成功实现CRISPR-Cas9技术对弓形虫的基因编辑操作[23]。CRISPR-Cas9系统可用于弓形虫大规模、高通量和任意基因的基因编辑操作。相对于传统基因编辑方法的局限性，它不仅成本低、操作简单、更精确和更高效，有效地解决了弓形虫基因操作复杂的问题，并且可快速构建基因缺失虫株[24]。CRISPR-Cas9技术主要用于弓形虫的生物学研究、抗弓形虫药物和疫苗的研发、弓形虫基因的鉴定和筛选，尤其是CRISPR-Cas9可快速鉴定和敲除弓形虫的毒力基因。目前，通过CRISPR-Cas9技术所构建的候选弱毒疫苗株主要有RHΔGRA17、PRUΔCDPK2、RHΔTKL1、RHΔNPT1、ME49ΔLHD、RHΔMORN1、ME49-ΔADSL等。

3.1RHΔGRA17弱毒株 RHΔGRA17弱毒株是弓形虫RH虫株的GRA17基因缺失的弱毒虫株。GRA17基因是具有潜在免疫原性的毒力基因，它可以调控弓形虫纳虫泡的稳定性并与营养摄取有关[25]。GRA17蛋白位于纳虫泡膜上，决定了其膜的通透性，若GRA17过表达则会加快弓形虫的生长速度[26]。用5×104个RHΔGRA17速殖子免疫小鼠，可以对弓形虫急性、慢性和先天性感染均产生显著的保护作用[27]。RHΔGRA17引起小鼠体内强烈的Th1和Th2反应，在先天性感染中使仔鼠的成活率和体重都有显著的提高[27]。

3.2PRUΔCDPK2 弱毒株CDPK2基因是弓形虫钙依赖性蛋白激酶家族的一员，CDPK2在调节支链淀粉的形成和降解中起着关键作用[28]。弓形虫以支链淀粉的形式储存能量，支链淀粉转化所需酶的磷酸化是依赖于CDPK2，CDPK2的活性由Ca2+信号调节[28]，所以CDPK2将Ca2+信号与弓形虫内支链淀粉的降解联系了起来。若CDPK2被破坏，支链淀粉在弓形虫体内会大量聚集[29]。此外CDPK2与弓形虫缓殖子的形成有关，CDPK2基因的缺失可导致缓殖子期的超微结构改变和活性丧失[29]。PRUΔCDPK2免疫后小鼠主要产生的是Th1型免疫应答，可在高剂量的弓形虫RH株攻击下延长小鼠存活时间[29]。PRUΔCDPK2在小鼠体内可诱导强烈的免疫保护应答，是潜在的弓形虫弱毒疫苗虫株。

3.3RHΔTKL1弱毒株 RHΔTKL1是由弓形虫RH株敲除TKL1基因所构建的。TKL1基因与弓形虫的粘附作用和毒力有关，当TKL1基因被敲除后弓形虫对小鼠的毒力就会丧失，所以TKL1是潜在的毒力基因[30]。使用1×106个弓形虫RHΔTKL1速殖子接种小鼠，可对急性、慢性和先天性弓形虫病具有显著的保护作用，并且被RHΔTKL1免疫的小鼠死亡率和胎儿流产率均大幅度降低，所以弓形虫RHΔTKL1是一种有前途的候选弱毒疫苗株[30]。

3.4RHΔNPT1弱毒株NPT1基因是弓形虫假定转运蛋白的成员，它在弓形虫摄取阳离子氨基酸的过程中起着重要作用[31]。在弓形虫RH株上敲除NPT1基因后构建RHΔNPT1菌株，用1×106个RHΔNPT1速殖子免疫小鼠后再用RH、PYS和Pru虫株的速殖子和Pru虫株的包囊通过不同的感染途径攻击感染小鼠，均100%存活[31]。RHΔNPT1弱毒株不仅能完全保护不同基因型弓形虫株的急性感染，在慢性感染中还能提高小鼠的存活率，减少脑包囊的形成[31]，也是一种具有潜力的弓形虫减毒活疫苗株。

3.5ME49Δldh弱毒株LDH1和LDH2均为弓形虫乳酸脱氢酶基因，将这两个基因敲除后的弓形虫突变株为Δldh，Δldh速殖子在体外生长良好但在小鼠体内不能繁殖[32]。Δldh接种小鼠后可诱导机体产生强烈的细胞免疫应答，也引起部分的体液免疫应答，Δldh的毒力严重减弱，但其诱导的强烈免疫力在30 d内可对弓形虫Ⅰ型毒株的攻击产生有效的防护[32]，所以Δldh显示了它作为候选弱毒疫苗的巨大潜力。

3.6RHΔMORN1弱毒株 通过CRISPR-Cas9技术还探究了MORN1和MORN2基因在弓形虫I型RH株中的功能，MORN的全称为Membrane Occupation and Recognition Nexus，中文可翻译为膜占位和识别联结小体，MORN1伴随子代速殖子的产生[33]。研究证实MORN2基因的缺失不影响RH株在体外的生长速度，RHΔMORN1缺失株能够长时间刺激机体产生免疫应答，有效保护小鼠抵抗急性、慢性以及先天性弓形虫感染，可作为弓形虫候选弱毒疫苗株[33]。

3.7ME49ΔADSL弱毒株ADSL基因是弓形虫腺琥珀酸裂解酶基因，弓形虫是嘌呤缺陷型生物，ADSL基因参与弓形虫宿主嘌呤的相互转化和补救合成[34]。在弓形虫Ⅱ型ME49虫株的基础上对ADSL基因进行敲除，可以降低其速殖子生长速度，并且可以减弱其形成包囊的能力[34]。用100个ME49ΔADSL速殖子单次免疫小鼠可以对Ⅰ型RH株、Ⅱ型ME49株和Ⅲ型VEG株的攻击产生有效的保护作用[34]，ME49ΔADSL弱毒株可明显提高小鼠存活率和减少形成包囊的数量，在免疫后30 d或70 d再次用野生毒株对其进行攻击感染，小鼠存活率均为100%[34]，所以该弱毒株可作为一种很有潜力的弓形虫弱毒疫苗株进行深入研究。

4 展 望

综上所述，弓形虫的弱毒疫苗研究取得了重要进展，尤其是CRISPR-Cas9技术在弓形虫中的应用，加快了弓形虫弱毒疫苗株的构建及评价的速度。CRISPR-Cas9技术也有自身的缺陷，例如脱靶率较高，PAM序列限制等问题。通过敲除形成的弱毒疫苗株存在不能完全防止水平传播和垂直传播、不能100%阻止包囊的形成等缺陷；弱毒株对免疫功能缺陷者会不会产生反毒现象？这些弓形虫基因敲除弱毒株目前只在小鼠模型上取得了较好的保护作用，在其他动物模型如猫及食品动物或者人类身上是否同样适用？这一系列问题还有待进一步解决。

到目前为止，弓形虫弱毒疫苗株只在小鼠上进行了毒力评价，还需要进一步在食品动物体内进行评价，尤其是猪、牛、羊等。除单基因敲除外，我们应该考虑构建多基因敲除株。在未来弓形虫疫苗的研制中候选基因的选择、免疫佐剂、免疫剂量、免疫途径的优化等，这些都是弓形虫疫苗研究中需要攻克的难关。弓形虫病的最终防控是希望弓形虫疫苗能在猫上成功应用，从而阻断弓形虫的传播。相信随着科学技术的不断发展，最终将研发出安全有效且对人、猫和各种食品动物完全保护的弓形虫疫苗，保护人类健康和促进养殖业的发展。

利益冲突：无