2019年云南省玉溪市输入性登革热病例实验室检测结果分析

田 杰，范芝宏, 杨 娟, 蒋雪莹, 杨明东, 郭晓芳

登革热(Dengue fever，DF)是由登革病毒(dengue virus, DENV)引起的急性蚊媒传染病，主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。DENV有4个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)[1]。2019年，WHO将登革热列为“2019年全球十大健康威胁”之一[2]。目前全球有128个国家，约39亿人口处于疾病风险之中，年感染DENV人数3.9亿[3-4]。2015-2018年我国广东、云南、浙江、福建、海南、湖南和山东省累计报告登革热暴发111起，共涉及12 490例病例[5]。云南省位于我国西南部，边境线4 060 km，与常年有登革热流行的缅甸、老挝、越南接壤。仅2009-2014年，从东南亚输入云南的登革热病例为384例[6]。自2013年云南省首次暴发登革热以来，瑞丽市每年均有登革热的暴发流行[7]。而景洪市于2013年、2015年和2017年先后发生了DENV-3、DENV-2和DENV-1的暴发流行[7-9]。2013-2018年，玉溪市除了2016年，每年仅有1～3例输入病例报告，分别来自云南西双版纳州及泰国、老挝、缅甸和马来西亚。为弄清2019年玉溪市输入的登革病毒血清型及病毒来源，本研究对登革热病例样本进行病原检测和分析，为当地登革热防控提供病原学依据。

1 材料与方法

1.1材料 2019年输入玉溪市的登革热疑似病例和临床诊断病例的诊断依据为《登革热诊断》WS 216-2018[10]。采用广州万孚生物技术股份有限公司生产的胶体金法登革病毒NS1抗原检测试剂作为病例临床诊断试剂。血清样本采集后冷藏运输至本实验室-80℃冰箱保存待检。病例个案信息来自国家传染病报告信息管理系统。

1.2方 法

1.2.1DENV RNA提取和血清型分型 吸取200 μL血清样本，用西安天隆公司生产的病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)提取病毒RNA。参考《登革热诊断》WS 216-2018合成DENV1-4型特异引物和探针，用实时荧光RT-PCR进行DENV血清型分型。PCR试剂为ABI AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit(AM1005)。PCR反应条件设置为：50 ℃ 30 min，95 ℃ 10 min；95 ℃15 s，60 ℃ 45 s，运行40个循环，荧光信号的收集设置在每次循环的退火延伸时进行。结果判断以Ct值<35(荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图呈“S”形的标本)可判断为相应的登革病毒核酸检测阳性。

1.2.3相似性和进化分析 用Megalign分析所得E基因序列的核苷酸相似性和氨基酸同源性。进化分析的参考序列下载自美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库，包括在NCBI数据库BLAST模块对获得的E基因序列进行比对后选取的相似性最高的基因序列、各血清型登革病毒的基因型代表序列和近年东南亚国家的登革病毒序列。以及本实验室检测获得的2019年景洪市1-3型登革病毒E基因序列。用MEGA 7(http://www.megasoftware.net)中的ML法进行遗传进化树构建，模型选用 Kimura2-parameter model。Bootstrap 值设定为1 000。

2 结 果

2.12019年输入性登革热病例 2019年玉溪市累计报告输入性登革热病例23例。4月至10月，除7月外，每月均有输入病例报告。在4月份监测到首例从越南芽庄输入的登革病例，在5月、6月和10月共监测到从柬埔寨输入病例3例，8月监测到从缅甸输入病例1例，9月3日至10月24日，从云南省西双版纳州输入18例。输入病例主要分布在江川区(9例)和红塔区(8例)。23例输入病例年龄在21～56岁，年龄中位数为30岁。男性12例，女性11例。人群分类为农民11例、家务及待业5例、工人1例、民工1例、不详5例。

2.2DENV血清型分型和基因分型结果 从20份血清样本(包括17份从西双版纳州景洪市输入样本，2份为从柬埔寨输入样本，1份为缅甸输入样本)中共检测到18份DENV阳性，其中在17份景洪输入样本中检测到11份DENV-1、5份DENV-2和1份DENV-3；在2份柬埔寨输入样本中检出1份DENV-1阳性；1份缅甸输入样本为DENV阴性。20份样本采血时间为发病后3～10 d。1例DENV阴性的柬埔寨输入样本为NS1抗原检测阳性，为发病后第5 d采集。1例DENV阴性的缅甸输入样本为NS1抗原检测阴性，为发病后第6 d采集。

2.3DENV E基因相似性与进化分析 对18份DENV血清型阳性样本进行RT-PCR和测序，仅从17例景洪市输入的DENV阳性样本中得到6条DENV-1 E基因序列(1 485 bp)、3条DENV-2 E基因序列(1 485 bp)、1条DENV-3 E基因序列(1 479 bp)。

6条DENV-1 E基因序列的核苷酸相似性为99.4%～100%，氨基酸同源性为99.6%～100%。与从GenBank下载的31条参考序列、4条2019年景洪市本地流行的E基因序列进行进化分析。结果显示，共41条序列分为5个基因型，6株DENV-1均属于基因I型，分别位于两个不同的进化分支(a，b)中(图1)。a进化分支的序列由2019年流行的DENV-1组成，源自云南玉溪市(9-10月)与景洪市(9月)、广州(10月)、江西南昌市(6月)、河南(8月)和柬埔寨(6月)。在a进化分支中，4条玉溪市E基因序列(19YX7、19YX12、19YX14、19YX15)与2019年景洪市本地流行株(JH48、JH57、JH60)和2019年广州流行株(GenBank号：MN921432)的核苷酸相似性为100%。b进化分支的序列均为2019年流行的DENV-1，源自云南玉溪市(9-10月)与景洪市(9月)、江西南昌市(4月)、广州(9月)和柬埔寨(4-5月)。该进化分支中2条E基因序列(19YX2、19YX13)与2019年景洪市本地流行株(JH78)、2019年从柬埔寨株(MW314720)、2019年广州流行株(GenBank号：MN921447、MN923083)和2019年南昌株(GenBank号：MN894235)的核苷酸相似性最高为100%。

▲为2019年输入玉溪的DENV-1 E基因序列；●为2019年景洪市本地流行的DENV-1 E基因序列

3条DENV-2 E基因序列核苷酸相似性为91.1%～99.9%，氨基酸同源性为97.4%～99.8%。与从GenBank下载的24条序列及2019年在云南景洪市本地流行的5条E基因序列进行进化分析。结果显示，共32条序列分为5个基因型，3株DENV-2分布在亚洲Ⅰ基因型(Asian I)和全球基因型(Cosmopolitan)中，均与2019年景洪市流行株位于同一进化分支中(图2)。1株 全球基因型(YX8)与2019年景洪市流行株(JH22)的核苷酸相似性为99.8%，氨基酸同源性为99.6%。2株AsianⅠ基因型(YX1/YX4)与2019年景洪市流行株(JH38/JH89/JH92/JH100)的核苷酸相似性为99.8%～100%，氨基酸同源性为99.8%～100%。

▲为2019年输入玉溪的DENV-2 E基因序列；●为2019年景洪市本地流行的DENV-2 E基因序列

1条DENV-3 E基因序列(YX5)与从GenBank下载的23条序列及2019年景洪市的1条E基因序列进行进化分析。结果显示，共25条序列分为4个基因型。YX5与2019年景洪市流行株(JH75)位于同一进化分支，属于基因Ⅲ型(图3)。YX5与2019年景洪市流行株(JH75)的核苷酸相似性为99.3%，氨基酸同源性为100%。

▲为2019年输入玉溪的DENV-3 E基因序列；●为2019年景洪市本地流行的DENV-3 E基因序列

3 讨 论

2019年登革热在全球范围内广泛流行，美洲和亚洲区域多个国家和地区登革热流行强度超过2018年同期水平[11-14]。2019年7-9月在东南亚和西太平洋地区，菲律宾、马来西亚、新加坡、越南、柬埔寨等国家是受疫情影响最为严重的国家[12-14]。由东南亚国家输入的登革热病例高于去年同期水平，国内广东、云南、江西和福建等省份暴发本土群聚性疫情[11,13]。

玉溪市位于滇中腹地，交通便利，存在登革热输入的便利条件。2019年4月至10月，玉溪市共监测到来自西双版纳州、柬埔寨、缅甸和越南的输入性病例23例，其中18例为9月至10月从西双版纳州输入，无本地登革热病例报告，与往年相比输入病例数量和输入来源地区/国家数量均有增加，且输入病例来源以西双版纳为主。输入病例以成年人为主，分布于9县/区中的7个县区，主要分布在江川区和红塔区。人群分类以农民、家务及待业为主。登革热传播媒介白纹伊蚊在云南呈全省性分布[15]，玉溪市属于亚热带季风气候，温和湿润，有利于蚊虫孳生，2015年玉溪市在中心城区首次监测到白纹伊蚊且密度较高[16]，因此玉溪市存在因登革热输入引起本地传播及暴发的风险，提示今后应在全市范围内进一步加强对农民、家务及待业等人群的登革热防控知识宣传和病例监测工作。

对输入病例进行病原检测和E基因进化分析发现，2019年从景洪市输入的病例中检测到3个血清型的登革病毒(DENV-1/DENV-2/DENV-3),其中6株DENV-1属于基因I型，3株DENV-2属于两个基因型(Asian I基因型和Cosmopolitan 基因型)，1株DENV-3属于基因Ⅲ型。溯源分析发现，输入的DENV-1 E基因序列均与2019年景洪市本地流行株E基因序列相似性为100%，与病例的流行病学史相符。同时，与2019年从柬埔寨输入云南的病毒株、2019年广州和江西南昌流行株进化关系较近。输入的3株DENV-2 分别属于Asian I基因型和Cosmopolitan 基因型，均与2019年景洪市DENV-2本地流行株位于同一进化分支，核苷酸相似性最高，与病例流行病学史相符。其中Asian I基因型序列与东南亚国家流行株进化关系较近，位于同一大的进化分支中。Cosmopolitan 基因型的序列与2017-2019年广州、泰国流行株进化关系较近。输入的1株DENV-3 E基因序列属于基因III型，与2019年景洪市流行株的核苷酸相似性最高为99.3%，氨基酸同源性为100%，与病例流行病学史相符。同时，与2019年缅甸流行株进化关系较近，位于同一进化分支。

综上所述，2019年玉溪市输入性登革热病例中存在境外输入和本省其它地区输入两种类型登革病例，输入型病例携带3种登革病毒(登革病毒1、2和3型)，病毒分子遗传进化分析结果提示输入性登革病毒与东南亚国家流行的登革病毒毒株进化关系最近，提示需进一步加强登革热境内外输入病例的检测和监测，同时加强登革热防控知识宣传工作。

利益冲突：无