细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染对Balb/c小鼠淋巴细胞亚群的影响

曹得萍，张耀刚，姜博璠，李建华，庞明泉,4，陈 根

棘球蚴病是一种对人类危害严重的人兽共患寄生虫病，俗称包虫病。包虫病最常见的两种类型分别是细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染所致的细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病。我国受包虫病威胁的高危人口有5 000万，被感染的家畜及其它动物超过亿头(只)[1]。包虫病病程长，治疗费用较高，给患者及其家庭带来极大的痛苦和沉重的经济负担，目前包虫病仍然是我国西部农牧区感染最为严重的人兽共患病之一[2]。多房棘球蚴病对人类的危害更大，感染后几乎100%原发在肝脏，其它部位的病变是由肝脏转移而来的，其生长方式类似恶性肿瘤，又称为“虫癌”[3]。目前对细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染后的免疫机制还不甚明了，本研究通过腹腔注射细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫原头节建立继发性细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病Balb/c小鼠模型，利用流式细胞术探讨感染细粒棘球蚴和多房棘球蚴小鼠脾脏和血液中T、B、Th1、Th2、Treg、NK细胞变化情况，旨在探讨T、B、Th1、Th2、Treg、NK细胞在细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染小鼠模型中的免疫作用，为进一步研究细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染的免疫机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1建立细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染小鼠模型

1.1.1细粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型建立 收集西宁市屠宰场绵羊肝脏细粒棘球蚴囊泡，在实验室无菌状态下收集囊内原头节，无菌含双抗(青霉素1 000 U/mL，链霉素1 000 U/mL)洗涤3次，配成6 000个/mL悬液备用。选取18～20 g左右Balb/c雌性小鼠30只，每只小鼠右下腹0.5 mL原头节悬液注射。

1.1.2多房棘球蚴感染Balb/c小鼠模型建立 剖杀多房棘球蚴保种沙鼠，无菌取出多房棘球蚴囊泡，眼科剪剪碎，分离原头节，无菌含双抗(青霉素1 000 U/mL，链霉素1 000 U/mL)洗涤3次，配成6 000个/mL悬液备用。选取18～20 g左右Balb/c雌性小鼠30只，每只右上腹做一小手术切口，暴露右叶肝脏，注射0.2 mL原头节悬液后缝合切口。6个月后剖杀小鼠，提取脾脏淋巴细胞。取20只小鼠腹腔注射0.5 mL生理盐水作为对照组。

1.2实验方法

1.2.1小鼠脾脏淋巴细胞分离 称取0.1 g小鼠脾脏置于无菌小培养皿中，利用5 mL注射器芯在70目的筛网上研磨，去除纤维组织等，边研磨边加入匀浆冲洗液，使细胞全部通过筛网到小培养皿中。弃去筛网，组织研磨液经 1 000 rpm/min离心 10 min，弃上清。用样本稀释液重悬组织细胞，将细胞悬液调整为2×108～1×109/mL的细胞浓度为宜，约使用 1 mL 样本稀释液重悬细胞，备用。淋巴细胞分离按照天津市灏洋生物制品科技有限责任公司的淋巴细胞分离试验流程进行。

1.2.2小鼠血液淋巴细胞提取 小鼠进行眼球摘除采血，血液滴入一次性的抗凝真空抽血管，在无菌的塑料离心管中加入2 mL淋巴细胞分离液，在装有小鼠血样的真空管中加入等量PBS混匀。缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，使血样尽量位于提取液上层，然后1 500 rpm/min离心15 min。

1.2.3细胞抗体标记上机检测 CD3+、CD4+、CD8+、CD19、CD25、CD16/CD32单抗孵育约30 min，上机检测(机型：BD FACSCelesta)。

1.3统计方法 细胞比例以百分数表示，GraphPad Prism 8.0进行统计图制作，用SPSS19.0进行统计分析，两组独立样本比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1流式细胞仪分析小鼠脾脏淋巴细胞亚群 T细胞在多房棘球蚴感染组(56.95±13.09)%和对照组(57.79±5.71)%比较，二者差异无统计学意义(t=0.025，P>0.05)；NK细胞在多房棘球蚴感染组(12.3±5.65)%和对照组(11.02±4.03)%比较，二者差异无统计学意义(t=0.800，P>0.05)。B、Th1、Th2、Treg细胞在多房棘球蚴感染组和对照组比较，差异有统计学意义(tB=4.239,P<0.05;tTh1=2.965,P<0.05;tTh2=2.403,P<0.05;tTreg=2.752，P<0.05)；T细胞在细粒棘球蚴感染组(64.71±21.26)%和对照组(57.97±5.71)%比较，二者差异无统计学意义(t=1.271，P>0.05)；NK细胞在细粒棘球蚴感染组(10.97±3.56)%和对照组(11.02±4.03)%比较，二者差异无统计学意义(t=0.029，P>0.05)，B、Th1、Th2、Treg细胞在细粒棘球蚴感染组和对照组比较，差异有统计学意义(tB=3.396,P<0.05;tTh1=3.539,P<0.05;tTh2=3.731,P<0.05;tTreg=2.197，P<0.05)。结果如表1和图1、图2。

表1 细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染Balb/c小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例变化

对照：无感染多房棘球蚴小鼠组；实验：感染多房棘球蚴小鼠组

对照：无感染细粒棘球蚴小鼠组；实验：感染细粒棘球蚴小鼠组

2.2流式细胞仪分析小鼠血液淋巴细胞亚群 T、B、Treg、NK细胞在多房棘球蚴感染组和对照组比较，差异无统计学意义(tT=0.029,P>0.05;tB=1.746,P>0.05;tTreg=2.183,P>0.05;tNK=1.690，P>0.05)，Th1、Th2在多房棘球蚴感染组和对照组比较，差异有统计学意义(tTh1=3.669,P<0.01;tTh2=4.302，P<0.01)；T细胞在细粒棘球蚴感染组(70.31±9.84)%和对照组(61.92±9.02)%比较，二者差异无统计学意义(t=1.967，P>0.05)，Treg细胞在细粒棘球蚴感染组(6.29±3.39)%和对照组(7.39±2.18)%比较，二者差异无统计学意义(t=0.923，P>0.05)；B、NK、Th1、Th2细胞在细粒棘球蚴感染组和对照组比较，差异有统计学意义(tB=2.125,P<0.05;tNK=3.569,P<0.05;tTh1=6.532,P<0.05;tTh2=4.463，P<0.05)。结果如表2和图3、图4。

表2 细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染Balb/c小鼠血液淋巴细胞亚群比例变化

对照：无感染多房棘球蚴小鼠组；实验：感染多房棘球蚴小鼠组

对照：无感染细粒棘球蚴小鼠组；实验：感染细粒棘球蚴小鼠组

3 讨 论

T淋巴细胞对肿瘤细胞有直接杀伤作用，承担着肿瘤免疫监视作用[4]。T淋巴细胞主要分为CD4+和CD8+T细胞亚群，在宿主防御反应和免疫介导的疾病中起着决定性作用[5]。在寄生虫感染的免疫应答中，CD4+T细胞各亚群，尤其是辅助性T(Th)细胞具有关键作用。寄生虫进入机体后，宿主体内具有抗原特异的T、B细胞被诱导分化成效应细胞，对寄生虫生长形成抑制或促进寄生虫的死亡[6]。研究发现Th1与Th2两种细胞在寄生虫感染的宿主免疫反应过程中发挥重要作用，棘球蚴通过增加Th2 型细胞因子表达和抑制Th1型细胞因子的表达来干预宿主的细胞免疫[7-8]。

本研究中，多房棘球蚴感染小鼠脾脏中Th1/Th2比值约为2.8∶1，说明多房棘球蚴感染后血液中主要以Th1介导的细胞免疫为主。多房棘球蚴组Treg细胞和B细胞数量与对照组相比较有所减少，说明机体的体液免疫有所抑制而细胞免疫起主导作用。究其原因可能是多房棘球蚴的生物学特性类似肿瘤，在多房棘球蚴寄生的微环境中寄生虫释放抗原刺激机体激发了细胞免疫。细粒棘球蚴感染小鼠脾脏中Th1/Th2比值约为1.6∶1，说明细粒棘球蚴感染后主要以Th2介导的体液免疫为主，小鼠体内以Th2型T细胞的反应起主导作用。细粒棘球蚴的囊壁将囊内容物与周围肝脏组织隔绝，从而使宿主体液免疫几乎不能影响到虫体的存活和增殖。Rigano等[9]发现细粒棘球绦虫主要抗原分子B可使PBMC产生Th1/Th2比值改变，倾向于病理免疫相关的Th2型反应，本实验细粒棘球蚴感染组脾脏中的Th1/Th2比值结果与此文献结果一致。

调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)通常是指CD4+CD25+Foxp3+T 细胞，是一种具有免疫抑制功能的细胞亚群，通过主动调节的方式抑制存在于机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而调节机体的免疫应答[10]，具有干扰免疫疗法的作用[11]。机体感染寄生虫后发生了抗寄生虫感染免疫，机体产生免疫病理损伤，当寄生虫感染进展到慢性期时，Treg细胞水平上升抑制炎症反应，产生保护机体的作用[12]。Treg细胞在多房棘球蚴和细粒棘球蚴感染组小鼠脾脏中的变化有统计学意义(P<0.05)，而在血液中Treg细胞变化无统计学意义(P>0.05)。这可能是由于寄生虫抗原在脾脏刺激各种淋巴细胞发生反应，Treg细胞则可能要起调节作用，故引起Treg细胞比例变化。但是血液中多房棘球蚴和细粒棘球蚴感染组Treg细胞变化无统计学意义(P>0.05)，这或许是本研究中样本数量问题，又或许这本身就是多房棘球蚴和细粒棘球蚴感染后外周血淋巴细胞的一个特征。研究发现细粒棘球蚴感染小鼠6个月和12个月时肝脏髓源抑制性细胞和Treg细胞比例增加，提示在小鼠感染细粒棘球蚴中后期Treg细胞发挥了免疫调节作用[13]。

本研究的目的是分析感染这两种棘球蚴后小鼠脾脏和血液免疫细胞的变化情况，为弄清感染棘球蚴后机体的免疫机制提供实验依据。后续研究中将动态监测小鼠脾脏和血液各淋巴细胞亚群变化情况，尤其从CD4+、CD8+、Treg细胞分型等分析多房棘球蚴和细粒棘球蚴感染过程中机体的免疫机制。

利益冲突：无