2019年广东省梅州市首起人间布鲁氏菌病暴发疫情的调查

孙长云，黄天鹏，韦入丰，张 薇，邓爱萍，彭晓放，曾灵风，张少忠，黄元祥，武 婕

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏杆菌感染而引起的一种具有传染性的人兽共患病。该病可通过直接接触受感染动物或间接食用受污染的肉和乳制品等而发生。布病患者的主要临床表现为低烧、夜间盗汗、关节及肌肉阶段性疼痛等症状[1]。随着广东省经济的快速发展，人们的生活水平发生了实质性的改变，对于肉类和奶制品等产品的需求量不断增加。外地输入的部分病畜未能及时进行检疫，混入市场，从而导致布病的暴发事件增加[2]。历史上广东省一直以猪种布鲁氏菌病为主，自2006年以后转变为更具感染性的羊种为主要种型，呈现出各地区布病病例逐渐递增的发展趋势[3]。布病不仅给地方畜牧业的发展造成严重影响，更重要的是给人们的生命健康带来了严重的威胁[4]。

本研究收集2019年广东省梅州市五华县发生布病疫情的数据，并采集具有相关症状人群的血液进行血清学和分子生物学方法鉴定，同时对可疑病羊的羊奶进行分子生物学检测。对血清学显示阳性的病人血样进行布鲁氏菌实验室分离与种型鉴定。为进一步了解本次分离菌株与其他标准菌株各生物种型之间的关系，选取14株分离布鲁氏菌株进行了多位点序列分型(MLST)研究，从根源上了解此次布病疫情的暴发的原因，同时也为更好掌握广东省布病疫情动态和分析流行特征提供有力数据。

1 材料与方法

1.1资料来源 采集的血液样本及羊奶样本均来源于广东省梅州市五华县。布鲁氏菌病病例的数据资料来源于广东省急性传染病监测系统，主要包括病例的临床症状和人群基本特征等。

1.2血清抗体检测 无菌环境下，采集静脉血2～3 mL，离心后获得血清，经虎红平板凝集试验(RBPT)进行初筛。初筛阳性者再通过试管凝集试验(SAT)进行复核确认。上述试验结果均依据布鲁氏菌病诊断标准，以RBPT阳性且SAT滴度≥1∶100判定为血清抗体阳性。

1.3分子生物学检测

1.3.1引物设计及合成 根据张辉等[5]报道的针对布鲁氏杆菌外膜蛋白基因Omp22序列设计的特异性引物和参考细菌16S rRNA基因引物，委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如表1。

1.3.2基因扩增及测序 按照血液基因组DNA抽提试剂盒(TIANGEN，DP304)所述方法提取血液和羊奶的基因组DNA，并保存于-20 ℃以备后续试验使用。应用表1合成的引物，以提取的血液和羊奶DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系均为50 μL：DNA模板4 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，Premix Taq 25 μL，ddH2O 17 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃(Omp22基因)和56 ℃(16S rRNA基因)退火1 min，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物送广州昊天生物科技有限公司进行测序。

表1 布鲁氏菌Omp22和16S rRNA基因引物序列

1.4布鲁氏菌Omp22基因和16S rRNA基因序列遗传进化树分析 测序结果结合GenBank中布鲁氏菌的Omp22和16S rRNA参考序列进行序列比对，通过生物学软件Mega 6.0应用邻位相连法(Neighbor-joining method)构建系统进化树[6]。

1.5病原菌的分离与常规方法鉴定 无菌条件下，共计采集血液样品18份，无菌操作接种至血培养瓶。带回生物安全三级实验室后转接至培养箱中进行可疑菌的分离与培养。对分离的可疑菌分别进行单因子血清凝集试验、染料抑菌试验和噬菌体裂解试验。具体操作步骤参考国家布鲁氏菌鉴定的标准方法进行[7]。

1.6AMOS-PCR分型鉴定 AMOS-PCR根据姜海等[8]报道，选取AMOS-PCR引物序列并委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如表2。AMOS-PCR扩增扩增体系: 2×Premix Taq 10 μL; 引物 IS711(10 pmol/μL)1 μL; 引物 A、M、O、S(10 pmol/μL)各0.4 μL; 模板DNA 2 μL，ddH2O 5.4 μL。AMOS-PCR扩增条件: 95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min;最终延伸 72 ℃ 5 min, 35个循环。待扩增完毕，PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测并观察结果。

表2 AMOS-PCR引物序列

1.7MLST分型 将14株布鲁氏菌全基因测序文件在数据库(https://pubmlst.org/)中查找到21个基因片段，包括布鲁氏菌19个管家基因(acnA、aroA、cobQ、csdB、ddlA、dnaK、gap、gyrB、leuA、mviM、prpE、soxA、trpE、caiA、fbaA、fumC、glk、mutL、putA)、1个外膜蛋白基因(omp25)和1个基因间区Int-hyp共21个基因片段作为MLST的靶标基因。使用 Bio Numerics(Version 6)将14株分离菌株与11株标准株和10株文献参考株用平均连锁聚类法(UPGMA)进行聚类分析，探讨各菌株间的进化关系。

2 结 果

2.1发病情况 本次疫情病例均居住在梅州市五华县华阳镇，主要分布在4个自然村，包括坪南、太坪、叶新和华南地区，其中坪南村和太坪村病例人数最多，占总病例的90%(27/30)。坪南村罹患率最高达32.67/万，如表3所示。

表3 梅州市五华县暴发布病疫情各地区的病例分布

2.2临床特征 本次疫情病例的临床表现主要是发热、乏力、多汗和肌肉关节酸痛等症状，其中70%都有发热的症状。具体如表4所示。

表4 梅州市五华县布病暴发疫情病例临床表现

2.3血清抗体检测 本次共采集了277个村民的血样，经RBPT初筛后有30份血清显示阳性反应。随后对这30份血清进行SAT试验，结果显示30份血清SAT滴度均≥1∶100，可以初步确定有30例布鲁氏菌病阳性患者。

2.4布鲁氏菌的16S rRNA基因序列遗传进化树结果 根据布鲁氏菌的16S rRNA基因构建的系统发育树可见，从血液和羊奶中分离到的布鲁氏菌16S rRNA基因序列可聚类在同一进化分支上，并能够很好的聚类。同时，来自血液和羊奶中检测到布鲁氏菌的16S rRNA基因序列与布鲁氏菌的标准参考菌株序列聚类在同一末端分支，而与其它菌株的16S rRNA基因序列相距较远(图1)。

图1 基于布鲁氏菌16S rRNA基因构建的系统进化树

2.5布鲁氏菌的Omp22基因序列遗传进化树结果 根据布鲁氏菌的Omp22基因构建的进化树可见，在血液和羊奶中检测到的Omp22基因序列聚类在同一末端进化分支上，与来自新疆地区的参考序列聚类在同一分支上，但与西班牙、德国和印度的分离株相距较远(图2)。

图2 基于布鲁氏菌Omp22基因构建的系统进化树

2.6细菌培养结果 在采集的18份血样中分离到14份有可疑菌落，菌落特征为无色半透明、湿润、边缘光滑、无色透明、呈针尖状。经革兰染色菌体呈红色短杆菌，柯氏染色菌体也呈红色短杆菌状。上述结果均符合布鲁氏菌的菌落形态和细菌形态特征。

2.7AMOS-PCR鉴定结果 AMOS-PCR扩增结果显示，14株分离菌株均可在731 bp大小处出现目的片段，与阳性对照组中的羊种布鲁氏菌处在相同位置，可判定14株分离菌株均为羊种布鲁氏菌(图3)。

M：DNA分子量标准；1-14：分离菌株；N：阴性对照；15：羊种菌；16：牛种菌；17：猪种菌

2.8种型鉴定结果 对分离的布鲁氏菌进行CO2需求、H2S产生、血清凝集反应、噬菌体裂解和染料抑菌试验，结果显示14份布鲁氏菌均为羊种3型菌株，表现为：CO2(-)、H2S(-)、单项特异性血清凝集A(+)M(+)R(-)、染料抑菌硫堇和碱性复红(+)、噬菌体裂解BK2(+)Tb(-)104Tb(-)。见表5。

表5 布鲁氏菌的种型鉴定结果

2.9MLST分型结果 经MLST聚类分析发现，本次疫情分离到的14株布鲁氏菌可聚类在同一个进化分支上，并与羊种布鲁氏菌聚类在同一个进化分支末端。其次，14株分离株与各标准生物型的布鲁氏菌的相似值介于82.0%～100.0%(图4)。

图4 广东省梅州市14株羊种布鲁氏菌MLST聚类分析

3 讨 论

布病因其对人类的危害大，且近几年呈现出疫情扩大的趋势，越来越受到重视。尽早的诊断布病是该病的防控关键，布鲁氏菌作为该病的病原体，由于初次分离培养时生长较为缓慢，应用传统微生物培养鉴定不利于早期的诊断，但分子生物学检测技术具有明显的优势[9]。目前文献中报道PCR检测布鲁氏菌的方法很多，在布鲁氏菌属水平的检测一般选用单对引物PCR，其中主要是以外膜蛋白Omp22、Bcsp31和IS711等的编码基因设计引物[5,10]。而在种及生物型水平的鉴定则选用多对引物的多重PCR方法，比如AMOS-PCR和多位点序列分型(MLST)等[8,11]。本研究在病例的血液和羊奶样本中均检测到了布鲁氏菌Omp22基因和16S rRNA基因，表明羊奶和病例的血液中均存在布鲁氏菌。经测序Omp22基因序列比对后结果发现，羊奶中的病原与血液中的布鲁氏菌序列相同，提示本次布鲁氏菌病疫情由生饮鲜羊奶所致。经布鲁氏菌16S rRNA基因构建的系统进化树分析，分离株与标准参考菌株聚集在同一末端分支，进化程度趋同，遗传距离相似，无法辨别菌株间遗传关系，实验结果表明16S rRNA不宜做布鲁氏菌遗传进化分析的靶基因，但可在属水平准确的鉴定布鲁氏菌，这与已有研究结果相似[12]。基于上述问题，对Omp22基因构建的进化树显示，本次检测的羊奶和人血液中扩增的布鲁氏菌Omp22基因在同一个进化分支上，而且同新疆地区的分离菌株相距较近，但与西班牙、德国和印度的分离株相距较远，提示此次布病疫情可能非进口羊所致，而可能与国内扩散性较高的羊型布鲁氏菌有关。

近年来，广东省人间布病疫情呈逐年上升趋势，每年都有患者中分离到布鲁氏菌菌株的案例[13]。此前，梅州市五华县从未有布病的流行报道，而随着该地区的经济发展和人们生活水平的不断提高，奶食品也成为了人们生活中重要的营养品之一。羊奶营养丰富，其中干物质和能量含量比牛奶稍高，非常适宜中老年人和婴幼儿饮用[14]。当地的部分村开发了小型家庭式山羊养殖场，为附近的村民提供了羊奶的供应需求。当地羊只的交易主要是通过流动式货车不定点销售，交易也较为隐蔽，由于经济利益的驱使，从疫区购入的未检疫的羊也混入其中，从而导致当地布病疫情的发生。再加之销售方及居民对布病的认知不足，从挤奶到包装都未进行有效的消毒处理，而且当地大多数居民有进食生鲜羊奶的习俗，这也导致了本次布病疫情的暴发流行。在本疫情中发现，生饮染疫羊生鲜羊奶的114人中，共有30人经确诊为布病阳性病例，而饮用煮沸的染疫羊生鲜羊奶的112人均未发现布病阳性病例。这进一步明确了此次疫情暴发流行的根源，为我们疫情的追踪和控制提供了有力数据。

本次疫情有30人的血清虎红平板试验显示阳性，期间成功采集到18人的全血进行布鲁氏菌分离试验，剩余12人赴医院就诊，未能成功采集到全血样本。随着感染者全血中布鲁氏菌的成功分离，通过AMOS-PCR的结果初步分析发现，本次的分离菌株均属于羊种布鲁氏菌。种型鉴定确定分离的布鲁氏菌均属于羊种3型布鲁氏菌。这与陈经雕等报道的广东省的布鲁氏菌株已经由猪种3型流行菌株转变为羊种3型流行株一致[15]。本研究采用MLST进行分析，发现本次疫情分离到的14株布鲁氏菌聚类在同一个进化分支上，并且与布鲁氏菌各标准株之间相似度为82.0%～100.0%。从MLST进化分支中发现，所有菌株在100.0%相似值水平上可分为13种ST型别，其中2株布鲁氏菌分离株(菌株编号为LB-127和LB-132)与来自内蒙古地区的ASM42086V1菌株ST型处于同一分支上，其余12株布鲁氏菌分离株与羊种参考菌株和标准菌株聚类在同一ST型进化分支上。以上有关MLST分析结果提示，本次疫情分离到的14株布鲁氏菌分离株，与羊种2型和羊种3型布鲁氏菌的亲缘关系最为相近，且与内蒙古地区参考菌株存在100%同源关系，可能是本次布病疫情的溯源地。本研究在生物分型的基础上结合MLST分型技术可以更好地对布鲁氏菌进行流行病学溯源调查和进一步明确菌株之间的遗传关系[16]。家庭式山羊养殖场的不断扩大，可能是造成广东省布病疫情呈逐年上升的主要原因。加强畜间布病疫情的监测、增强对进出省羊只的布病专项免疫、提高群众对布病的认知和防范意识是防控布病疫情的有效措施。

利益冲突：无