白色念珠菌、黏性放线菌与根面龋相关性的研究进展

2021-03-28熊开新邹玲

国际口腔医学杂志 2021年2期

熊开新邹玲

口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科成都610041

随着现代口腔医疗技术先进性和人们口腔保健意识提高，牙齿在口腔中存留的时间更长，龋病已成为全球患病率最高的疾病之一。老年人存在口腔护理相对较差、易患系统疾病而导致唾液腺功能受损、过量碳水化合物摄入、认知能力下降、牙龈退缩及牙根面暴露等牙周问题十分普遍等多种不利因素，目前老年人的主要口腔问题已由口内无牙转变成牙齿龋坏[1]。我国第4次口腔健康流行病学抽样调查显示，55~64岁老年人恒牙患龋率为95.6%，恒牙根龋的患病率为51%；65~74岁老年人恒牙患龋率为98%，恒牙根龋的患病率为61.9%。牙根部牙骨质和牙本质的羟磷灰石晶体较小，孔隙度较高，有机物含量较釉质高。牙本质中无机盐含量约占70%，有机物和水含量约占30%；牙骨质中无机盐含量为45%~50%，有机物和水含量为50%~55%：故根面龋的发生发展相对复杂，不仅包括硬组织脱矿，还包括复杂的胶原降解过程[2]。一方面，根部牙体组织矿化程度较低，根面龋在pH6.0~6.8，未到临界值pH5.5时即可发生[3]，且龈沟内大量龈沟液和食物残渣堆积，微生物极易于牙根部聚集，代谢产酸导致根面脱矿，进一步酶解有机质胶原致根面龋快速进展；另一方面，充填修复时存在操作空间的限制、唾液和龈沟液对消毒隔湿的干扰、牙周软组织对病损区的覆盖等不利条件，而且目前尚未开发出对根面龋洞粘接性能强而稳定的修复材料，这些因素均严重影响了根面龋的修复及预后[1,4]。因此，根面龋发病率高、治愈率低，形势十分严峻。

牙菌斑是龋病发生发展的始动因子。根面龋发生过程中，首先是微生物代谢产酸致无机物脱矿，酸性环境同时激活了宿主来源的内源性蛋白酶（主要包括基质金属蛋白酶和半胱氨酸组织蛋白酶）以降解暴露的胶原，随后微生物产生的蛋白酶（如胶原酶、明胶酶和肽酶等）也开始降解有机物，龋损逐渐进展，形成浅碟状、着色、软化的感染病损区域[2]。白色念珠菌和黏性放线菌作为口腔常驻共生菌群，属于机会致病菌，具有产酸、耐酸和酵解有机物等性能，在根面龋发生发展中扮演着重要角色。本文就白色念珠菌、黏性放线菌与根面龋的研究进展作一综述，以期从真菌-细菌控制的角度为根面龋的临床防治提供新思路。

1 根面龋菌斑微生物

放线菌属、链球菌属和乳杆菌属是根面龋中较常见的3种菌属[5]。随着生物检测技术的发展，丙酸杆菌、齿状罗氏菌、黏液奈瑟氏球菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、卵形拟杆菌和米氏链球菌等也被认为与根面龋密切相关[5-7]。

研究[8]发现，新发生根面龋的部位越多，放线菌的组成比例越大；而黏性放线菌不仅在检出数量上显著高于健康牙的根面菌斑，还可渗入牙本质深层。Nyvad等[9]通过体外实验证实，黏性放线菌是脱矿最明显的实验性根面龋菌斑中的主导微生物。除细菌外，根面龋菌斑中还普遍存在真菌。研究[7,10]发现，根面龋患者牙菌斑中白色念珠菌是最主要的真菌种类，占可检出真菌总量的98%左右。综上，白色念珠菌和黏性放线菌在根面龋菌斑样本中的存在十分普遍，由此推测，二者与根面龋的发生发展可能具有一定的相关性。

1.1 白色念珠菌

白色念珠菌是人类口腔、呼吸消化道以及泌尿生殖系统常见的共生真菌，有菌丝和孢子两种形态，随环境刺激，两种形态可以相互转化，其中菌丝态具有较高的致病毒力。白色念珠菌具有与变异链球菌相似的黏附、酵解碳水化合物、产酸、耐酸和形成生物膜等致龋毒力[11]。

研究[12]发现，白色念珠菌可以通过表达Sap、Als和Hwp1黏附素蛋白介导其在微生物、非生物物质（如牙齿表面羟磷灰石及有机胶原）和宿主细胞等的表面黏附，Eap1、Iff4、Ecm33、Mp65、Phr1和Int1等蛋白能促进白色念珠菌的黏附过程。白色念珠菌还能发酵葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖等多种糖类，形成丰富的胞外基质促进生物膜聚集[11]。白色念珠菌合成胞外基质的过程受Zap1、Gca1、Gca2、Bgl2、Phr1和Xog1等多种蛋白的调控[12]。另外，白色念珠菌可以酵解碳水化合物产酸，使环境pH迅速下降。Schlafer等[13]利用一种基于共聚焦的pH检测方法监测真菌生物膜的产酸能力，结果发现：白色念珠菌具有极强的产酸能力。还有研究发现，白色念珠菌临床分离株可在体外使釉质块脱矿，硬度降低[14]，且与变异链球菌共同作用时，显著增加了牙体硬组织的脱矿程度[15]。白色念珠菌还具有降解胶原的能力，可渗透进牙本质小管中并结合至胶原蛋白上，分泌酸性条件下能够活跃降解胶原蛋白的水解酶，促进龋坏进程[11-12]；同时，白色念珠菌可通过Rim101信号转导通路感知pH的变化，调控phr1和phr2基因表达以耐受酸性环境[12]，可在pH为4的酸性环境中生存[16]。白色念珠菌形成生物膜的过程不仅受黏附素相关基因als和hwp1的调控[12]，也与Hsp90、Bcr1、Tec1、Efg1、Ndt80、Rob1和Brg1等多种蛋白相关[12]。有学者[17]收集健康根面菌斑和龋坏根面菌斑进行转录组测序分析，结果发现：龋坏菌斑中白色念珠菌的代谢活性、糖转运、压力耐受、侵袭和pH调节相关毒力基因的表达较健康菌斑明显上调。综合这些研究可以推测，白色念珠菌与根面龋的发生有着重要的相关性。

1.2 黏性放线菌

黏性放线菌在根面龋发生的初始阶段发挥了不可替代的作用。黏性放线菌的致龋毒力主要与菌毛介导的黏附聚集作用、持久的产酸耐酸性能，以及蛋白凝固和降解能力有关。黏性放线菌Ⅰ型菌毛黏附素通过与牙齿胶原或唾液膜中的富脯蛋白（proline-rich polypeptides，PRPs）和富酪蛋白受体结合，介导细菌在牙齿表面的黏附，并与牙骨质和牙本质基质中Ⅰ型和Ⅲ型胶原相结合，进一步渗入牙本质小管中，加快根面龋的进展。本课题组前期体外研究[18]显示：黏性放线菌可黏附于唾液覆盖的羟磷灰石表面聚集形成生物膜，且与羟磷灰石之间存在较大的黏附力；Switalski等[19]通过体外研究发现：黏性放线菌能在30 min内快速黏附于牙根表面，且与变异链球菌相互竞争黏附位点。黏性放线菌还能代谢淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖等多种碳水化合物，迅速合成大量糖原，持续降解糖原产酸，且能长时间耐受酸性环境，保持代谢活性[20]。与健康根面菌斑中分离出来的黏性放线菌相比，根面龋菌斑中分离出来的菌株具有更强的耐酸性和糖原合成能力，并且其降解糖原产酸过程可维持更长的时间，从而引起牙齿脱矿[19-20]。

2 白色念珠菌与黏性放线菌的相互作用

龋病的发生发展是多种微生物相互作用、相互影响的结果。目前白色念珠菌和黏性放线菌之间存在协同还是拮抗作用尚存争议。有学者[21]认为：黏性放线菌可以通过产生尼可霉素和格尔德霉素抑制白色念珠菌的增殖、黏附、菌丝形成、生物膜形成和代谢酶活力，推测二者之间存在拮抗作用。但是目前多数研究认为，二者能够相互作用增强毒力，存在协同作用。体外实验[22-23]发现，白色念珠菌和放线菌能发生共聚反应，但共聚反应受白色念珠菌的菌株种类和培养基种类的影响，菌丝态生长的白色念珠菌能与放线菌形成更加明显的共聚效果。还有学者[24]通过荧光原位杂交技术结合共聚焦显微镜观察发现：放线菌能与白色念珠菌发生明显的共聚反应并形成致密的混合生物膜。Morse等[25]的研究结果显示：白色念珠菌与黏性放线菌共培养能明显增加生物膜中的菌丝含量，且共培养生物膜中白色念珠菌的毒力基因，如als3、epa1、pld1、sap4、sap6等的表达明显增高。为了进一步探索2种微生物之间的相互作用，笔者所在课题组也进行了白色念珠菌和黏性放线菌体外共培养实验，结果发现：共培养时，二者的增殖、产酸耐酸、产糖和生物膜形成等致龋毒力明显增强[18]；在此基础上进一步研究发现：白色念珠菌erg11基因在介导白色念珠菌与黏性放线菌的相互作用中具有重要作用[26]，但是二者之间具体的相互作用通路还有待进一步研究。

3 根面龋治疗新方向——以病原微生物控制为基础的材料改性

目前临床上根面龋充填修复后存在充填物脱落及继发龋坏等问题[1,27]。通过对根面龋病原微生物进行研究，以微生物控制为基础对修复材料进行抗菌性能改性可以作为根面龋治疗的新方向[1]。已有学者[28-29]通过体外研究发现：将甲基丙烯酸二甲基氨基己酯（dimethylaminohexadecyl methacrylate，DMAHDM）、非晶态磷酸钙（nanoparticles of amorphous calcium phosphate，NACP）和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC）掺入粘接剂中，改性后的新型粘接剂能够明显抑制多种病原菌生物膜的形成能力，减少活菌量及胞外多糖产量。这些多功能粘接剂有望用于龈下边缘的根面龋治疗并预防继发龋的发生。Zhou等[30]将DMAHDM和NACP掺入复合树脂中形成抗菌改性的生物活性复合树脂，可明显降低变异链球菌、嗜酸乳杆菌和白色念珠菌单菌种及3菌种生物膜的产酸、产糖能力和活菌数量，同时抑制生物膜介导的牛牙牙本质脱矿。采用这种多功能新型抗菌改性生物活性复合树脂修复根面龋，有望抑制根面龋坏的再发生。本课题组在前期研究中发现：将伏立康唑（voriconazole，VRC）掺入粘接剂中形成的抗菌改性粘接剂可明显抑制白色念珠菌和黏性放线菌双菌种生物膜的形成能力、代谢活性、产酸及产糖能力，同时明显降低了生物膜中的活菌比例，可作为根面龋修复的新型抗菌粘接剂。由此可见，通过研究根面龋病原微生物及其相互作用机制，并进一步筛选出特定药物进行修复材料抗菌改性，可以作为根面龋防治的新策略。