脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1基因调控口腔及全身骨代谢的作用

邓诗勇 宫苹 谭震

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院种植科 成都610041

作为人体重要器官，骨具有支持、运动、存储矿物质等作用，维持着人体进行正常的生理功能。骨的发育过程中，四肢骨、躯干骨及颅底骨等主要由软骨内成骨形成，该过程由软骨细胞为主导；颌骨、锁骨则由膜内成骨形成，由间充质干细胞分化为成骨细胞以直接形成骨[1]。骨组织并非一成不变，而是处于动态平衡之中，其中涉及骨形成与骨吸收，在多种因素下维持着动态平衡，一方面，软骨细胞与成骨细胞形成正常骨组织并发育成熟，另一方面，破骨细胞与成骨细胞相互作用与制约，二者的平衡与骨生理稳定至关重要[2]。骨代谢异常则可能导致疾病发生或诱发并发症，因而研究骨相关细胞活动及调控机制，对于相关疾病的防治具有十分重要的意义。

脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1（brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1，Bmal1）基因广泛参与调节生物体内生理活动。近年来，越来越多的研究发现其在骨生理及病理过程上起着重要作用[3]。通过影响间充质干细胞的成骨向分化、软骨细胞及破骨细胞的功能[4-6]，Bmal1基因分别从骨形成与骨吸收两方面参与调控骨生理，但其中的分子机制尚无定论。近年来，发现多种疾病中存在昼夜节律的变化，时相疗法的概念也应运而生[7]，骨组织中，包括颅面部骨，存在着节律的变化[8-9]，而牙槽骨的骨量变化一直是口腔医学领域的重要课题，因而探究骨代谢性疾病的昼夜节律调控机制具有重要意义。本文就Bmal1基因调控骨组织生理活动的研究进展作一综述，分析其中可能的分子机制，并讨论其在口腔及全身相关骨代谢疾病诊疗中可能发挥的作用。

1 Bmal1基因是参与机体正常生理活动的重要调节因子

对哺乳动物来说，大多数生理活动都在近日钟基因调节下，遵循24 h的昼夜节律，这种节律受外界光强、温度等因素的影响，环境信号的变化主要通过视网膜感知并传输至视交叉上核，并进一步作用于组织细胞中的局部振荡系统。近日钟基因包括Bmal1、生物钟循环输出蛋白（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）基因、周期（period，Per）基因家族、隐花色素（cryptochrome，Cry）家族及维甲酸相关孤儿受体等成员，Bmal1与Clock二者表达蛋白形成二聚体结合到Per与Cry基因启动子的E-box区域进而调控其表达，当Per与Cry表达达到峰值，反过来抑制Bmal1与Clock的表达，如此随着时间推移周而复始，形成周期振荡的负反馈调节系统[10]。

口腔及全身生理过程中广泛地存在着节律振荡及其调控，如人的牙龈及牙周膜成纤维细胞、牙髓来源干细胞、骨髓间充质干细胞等均被发现表达近日钟的组分[11-12]，机体生物节律的紊乱，尤其是Bmal1基因的表达降低可能诱发一系列疾病的发生。若敲除Bmal1基因，正常的生物节律被破坏，败血症、阻塞性肺部疾病、阻塞性睡眠呼吸暂停等疾病的风险将增加，其炎症发展将更为严重，其在头颈部鳞状细胞癌的诊断及预后判断中也存在潜在的应用价值[13]；昼夜节律的破坏，也将进一步导致机体的衰老变化，如白内障、皮下脂肪减少及器官萎缩等[14]。作为衰老的主要症状之一，骨的增龄性改变。同样，受Bmal1的调控：8周龄Bmal1-/-基因敲除小鼠骨吸收增加，骨量明显减少[5]；相比野生型小鼠，16周龄的Bmal1-/-小鼠胫骨长度更短[15]。研究发现，颅骨的矿化发育过程存在周期性，且与Per基因的表达节律相关[9]，包括Bmal1在内的多个近日钟基因元件在颅骨、牙槽骨及牙骨质中均有节律振荡的表达[16-17]，亦能影响正畸治疗的过程中牙周组织的重塑[18]，而Bmal1-/-小鼠基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表达升高，出现下颌骨发育不全的症状[19]。

近年来，在骨代谢领域，Bmal1的作用日益受到关注；另外，随着中国人口老龄化的加剧，骨质疏松、骨关节炎等增龄性疾病亟待解决，在口腔医学领域，在中老年患者群体中，牙周炎骨质丧失、种植体的成功率等问题也需要密切关注。因此，从时间生物学角度，研究骨的衰老变化及骨髓微环境中相关细胞的生理活动，可为相关骨代谢疾病提供新的思路，具有广阔的前景。

2 Bmal1基因通过多种途径调控骨生理

2.1 Bmal1基因可调控MSCs成骨-成脂分化

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）有多种组织来源，具有自我更新和多向分化潜能，在组织再生工程中被广泛使用，其增殖能力及分化命运的诱导一直是生命科学领域的研究热点。MSCs可分化为成骨细胞，在骨生理研究领域同样受到广大学者的密切关注。Bmal1基因与MSCs成骨分化关系十分密切。研究[8]发现，MSCs中的近日钟基因Bmal1与Per3二者表达亦呈8~12 h的交替节律变化，符合一般生物节律。Bmal1在包括骨髓的多种人体组织中广泛表达，随着间充质干细胞的老化，Bmal1表达呈增龄性降低，而其表达水平下降与MSCs的衰老与成骨分化能力的降低明显相关[20]。另外，老化相关的细胞内在因子改变可干扰MSCs的成骨-成脂平衡，更多转向成脂分化，而其成脂分化的过程同样受Bmal1调控[21]。通过转染过表达MSCs的Bmal1基因，能促进其增殖及成骨分化能力[22]，负向干扰Bmal1基因得出了同样的结论[23]；过表达Bmal1基因的负向调节因子Reverbα，其增殖与成骨能力则相应减弱[24]。体内实验同样表明Bmal1基因通过调控MSCs的成骨分化能力进而调节骨量[25]，糖尿病引起代谢失衡，导致骨丧失，过表达Bmal1也能恢复MSCs被抑制的成骨分化能力[26]。如今种植义齿已经成为牙列缺损或缺失的首选修复方法之一，种植体植入牙槽骨后形成特殊的异源物微环境，其中MSCs的成骨分化能力对种植体—骨之间形成直接的骨结合至关重要[27]。可以合理推测，Bmal1基因参与到种植体骨结合的形成及维持。一项研究通过全基因组芯片分析，发现种植体周组织节律基因表达明显变化[28]，在其中Bmal1的上调更为显著。而目前最常使用的是钛种植体，在钛生物材料表面培养MSCs，诱导了神经元PAS结构域蛋白2与Bmal1的异常共表达网络[29]。

Bmal1调控MSCs成骨分化的核心机制，目前尚缺乏定论。作为MSCs成骨分化的最为核心的信号通路之一，Wnt/β-连环蛋白通路被证实与Bmal1在促进成骨分化上存在协同作用，Bmal1基因转染的细胞中，核心因子β-连环蛋白的表达明显增强[30]，但二者在成骨中的相互作用机制需要进一步研究。另外，MSCs的老化与细胞周期相关p53/p21信号激活密切相关，而Bmal1对该通路起到抑制作用[31-32]，糖尿病导致的MSCs成骨分化能力减弱同样与Bmal1对p53信号通路的调控有关[33]，这也为Bmal1调控成骨分化的机制研究提供了可能思路；而有染色质免疫沉淀分析表明低氧应激通路作为与MSCs老化息息相关的调节因子，与Bmal1之间存在串扰[34]。综上可见，Bmal1基因参与调节多方面生命活动，与多种信号通路形成了复杂的分子调控网络，因此调控MSCs成骨分化机制研究线索虽众，但缺乏有力证据明确其核心通路。

2.2 Bmal1基因参与维持软骨细胞功能

生长板软骨细胞主导的软骨内成骨形成，对个体四肢发育具有重要作用。通过测定软骨细胞的有丝分裂指数、生长板高度，表明软骨组织同样具有昼夜节律[35]，超过600个软骨细胞表达的基因具有节律性，随着细胞老化，软骨的昼夜节律振荡幅度还将明显降低[36]。作为节律基因的核心因子，Bmal1基因参与维持软骨完整及软骨细胞功能。关节内间充质干细胞的Bmal1基因被敲除后，表现出更强的促炎性，软骨发育受到抑制[37]。骨关节炎（osteoarthritis，OA）的核心病理机制便是软骨细胞的功能异常与退化，已经证明在OA患者及老年小鼠软骨组织中BMAL1表达水平降低，软骨细胞中靶向敲除Bmal1基因，导致了小鼠关节软骨的退化，下游软骨主要基质相关转录因子SOX9，聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白Col2a1的表达降低[38]。

新近研究发现，Bmal1基因的敲除明显抑制了软骨细胞的增殖，MMP13表达增加，它的机制可能是通过低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）介导的信号通路[4]。BMAL1与HIF1α具有相似的蛋白结构域，二者相互作用，而作为HIF1的主要调控靶点之一，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作用于生长板软骨最后转化为骨组织的血管化过程[39]。可以看到，HIF1所代表的低氧诱导信号转导，不论是与软骨细胞还是成骨细胞均有密切关系，Bmal1通过这一途径同时参与调控膜内成骨与软骨成骨，值得进一步探索其在骨代谢相关领域的作用。此外，Akagi等[40]利用RNA-Seq测序推测乙型转化生长因子-β也可能是Bmal1调控软骨细胞功能的途径之一。

2.3 Bmal1基因调控成骨-破骨平衡

成骨细胞与破骨细胞分别行使的骨形成与骨吸收作用是骨改建的基本方面，它们相互协同又相互制约，共同维持骨组织的稳定，而以Bmal1为核心的近日钟基因在其中发挥重要作用，可能是今后骨再生医学的调控靶点。破骨细胞起源于单核/巨噬细胞，分化过程中核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）信号转导起核心作用，而成骨细胞可分泌护骨素（osteoprotegrin，OPG）竞争结合胞膜上的RANKL蛋白，抑制破骨细胞形成[41]；反之，破骨细胞可分泌信号素Semaphorin-4Dl来抑制成骨细胞的成骨功能[42]。Bmal1基因通过调节骨形成蛋白-2/SMAD1信号转导调节成骨细胞的成骨活性[43]，共培养实验表明，敲除Bmal1基因的成骨细胞具有更强的支持破骨细胞形成的能力，说明在二者的协同中Bmal1也起到了调节作用；Bmal1基因可上调OPG表达，进而抑制骨吸收，当其被特异性敲除，可以通过OPG的表达下调降低对破骨细胞分化的抑制[44]，这抑或与核因子（nuclear factor，NF）-κB通路相关。直接敲除破骨细胞Bmal1基因，对小鼠骨量无影响[45]，似乎表明Bmal1基因调控破骨细胞功能是间接作用，但昼夜节律的破坏直接影响了破骨细胞的功能，Xu等[46]提出Bmal1基因可通过与SRC家族及活化T细胞核因子的交互作用，进而促进破骨细胞分化，故破骨细胞特异性敲除Bmal1基因甚至增加了骨量。这种矛盾的出现基于成骨-破骨平衡机制的复杂性，Bmal1基因参与介导骨生理的双向平衡，如何厘清其中复杂的分子调控机制，明确Bmal1基因在各方面的作用，是当下研究其调控骨生理的难点。

3 Bmal1基因在异常骨代谢中的作用

Bmal1基因参与调节β-连环蛋白、HIF1、NFκB等关键转录因子表达，通过复杂的分子机制，调控MSCs、成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞的生理功能，维持骨代谢平衡。当受到外界因素刺激，平衡被打破则会引发骨代谢相关疾病或诱发并发症，在其中Bmal1基因及其代表的生物节律亦会受到影响，并对疾病恢复起到一定作用。

3.1 Bmal1基因与牙周骨质丧失

牙周炎是最常见的口腔慢性疾病之一，以菌斑为始动因子，主要表现为牙周组织的破坏，其中包括牙槽骨的骨质流失。牙周组织中表达昼夜节律基因，缺氧条件模拟炎症状态下牙周膜节律蛋白表达水平降低[47]。牙龈卟啉单胞菌（牙周炎的主要致病菌之一）可使Bmal1启动子甲基化，从而抑制Bmal1转录，Bmal1的下调介导NF-κB因子激活，进一步促进了炎症发展[48]。目前的牙周序列治疗难以修复已经缺损的牙周组织，而组织工程技术的出现为牙周病治疗提供了新的思路。种植体周围炎同样地存在着周围骨质的丧失，二者在临床特征及组织病理学上有着诸多相似之处，但种植体周围炎往往存在更多的炎性细胞浸润[49]。如前述，Bmal1基因与种植体骨结合的形成关系紧密，在失败的骨结合过程也发生上调。作为促进牙周组织愈合、牙槽骨缺损修复的干细胞基础，MSCs在牙周组织工程技术治疗中发挥了巨大作用[50-51]。研究显示，与牙周膜干细胞相比，MSCs的成骨分化能力更强，在炎症微环境中具有更强的免疫调节作用。近年来，Bmal1基因在促进MSCs成骨分化、逆转干细胞衰老方面发挥的作用日益受到关注，在控制炎症方面的作用也得到证实[52]，以此在菌斑控制的基础上，将为修复牙周炎及种植体周围炎牙周缺损提供新的思路。

3.2 Bmal1基因与骨质疏松

衰老和妇女绝经后状态是骨质疏松的两大主因，表现出骨量及骨密度的下降，并导致骨的脆性增加，增加骨折风险。小鼠经卵巢切除术模拟绝经后骨质疏松状态，发现包括BMAL1在内的昼夜节律调节蛋白表达降低[53]；自然衰老小鼠骨质退化，虽然昼夜节律正常，但应对外界刺激时观察到了年龄相关的运动节律破坏[54]。近日钟基因中，Bmal1的调节因子维甲酸相关孤儿受体和REV-ERBα可能是骨质疏松症的治疗靶点[55]，而其下游基因Cry2被证明与老年骨质疏松患者相关[56]，Bmal1作为反馈循环中的关键因子，对骨质疏松的直接作用有待证实，而鉴于Bmal1基因对MSCs老化的逆转作用，可为骨质疏松的再生治疗提供可能思路。

3.3 Bmal1基因与骨关节炎

OA常发生在四肢关节处，是关节软骨的退化损伤所导致，软骨细胞的功能异常或退化在其中占有重要作用。近年来，学者逐渐关注到骨关节炎中软骨的生物节律破坏与可能的治疗靶点，骨关节炎软骨细胞中Per2的表达较高，而Bmal1的表达则明显降低，提示软骨细胞内源性节律破坏可能是骨关节炎早期发展的关键[57]，而后RNA测序也证实了这一点[58]。而衰老作为骨关节炎的另一危险因素，同样受到Bmal1的影响。骨关节炎中软骨细胞的特征性表型改变，如SOX9表达减少，MMP13的产生增加，均受Bmal1及下游基因Per2的影响[59]。Bmal1通过调控软骨细胞功能，如形成软骨基质，进而参与维持软骨完整与修复，特异性敲除Bmal1基因，导致关节软骨的退化。HIF1、HIF2在软骨发育中发挥重要作用，可能成为治疗骨关节炎的可能靶点[60]，而Bmal1与HIF1之间存在交互，新近研究从体内与体外两方面证实了Bmal1通过HIF1/VEGF信号轴调控软骨发育，但目前缺乏对该机制研究的疾病模型，是进一步研究的热点。除以上骨代谢相关疾病之外，还发现骨性下颌发育不全中Bmal1表达下调，其机制可能是Bmal1的缺失降低了OPG表达，破骨细胞分化增强，而国内学者发现骨性下颌发育不全中Bmal1表达降低通过影响p65的磷酸化上调MMP3表达进而抑制了成骨分化。

4 总结与展望

目前，关于Bmal1基因调控骨生理病理过程的研究尚存在一定的局限性，首先体现在近日钟基因在组织中广泛表达，在长骨与颌骨中的具体作用尚且不明，同时其与众多分子信号均有交互，因而对分子机制的研究大多浅尝辄止，厘清其中核心的信号转导通路是当下研究的难点；其次，生物钟受到外界环境、自身情绪及精神状态等多种复杂因素的影响，需要克服多重因素的影响，构建精准的研究模型；最后，相关临床证据不足，明确Bmal1基因在骨代谢性疾病中发挥的作用，为疾病防治提供切实理论，需要进一步研究。

Bmal1通过对MSCs成骨分化的调控作用，为其在再生组织工程中的应用提供了理论可行性，或可应用于骨质丧失的再生治疗；其对机体的衰老、与低氧诱导信号转导在多方面的交互，为进一步研究调控骨生理的机制提供了可行方向。随着我国人口老龄化的加剧，进一步探究Bmal1基因对下游系列分子信号的作用，对探索口腔及全身骨代谢相关疾病的防治提供新的思路，具有深远意义。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。