基于非人灵长类动物模型的缺血性脑卒中治疗方法研究☆

秦振秀 刘竞丽

目前临床上首选重组组织纤溶酶原激活剂（recombinant tissue-type plasminogen activator，rt-PA）[1]或血管内血栓切除术（endovascular thrombectomy，EVT）[2]治疗缺血性脑卒中，但这些治疗远不能使绝大多数患者获益。因此需要找到其他有效的治疗方法来改善更多患者的预后。然而绝大多数在啮齿动物上有效的干预措施在临床试验中都失败了，这可能与啮齿动物在解剖学、遗传学、病理学以及药理学等各方面都与人差别大有关，而非人灵长类动物在各方面都与人类相近。所以使用非人灵长类动物对缺血性脑卒中的治疗方法进行有效性及安全性评价是进入临床研究的关键一步，目前这方面的研究较少。因此，本文将对以非人灵长类动物为模型的缺血性脑卒中的治疗方法研究进展进行综述。

1 药物疗法

目前在非人灵长类动物模型上研究的药物按机制分为酶/蛋白抑制药物；抗血栓形成的药物；清除自由基的药物；以及干预其他机制的药物，绝大多数这些药物治疗都能减少梗死面积以及改善神经功能，他们都可作为治疗缺血性脑卒中的主要候选药物。以下具体介绍每种药物的药效作用特点。

1.1 酶/蛋白抑制药物 4-（（1E）-2-（5-（4-羟基-3-甲氧基苯基-）-1-苯基-1 h-吡唑基-3-基）乙烯基）-2-甲氧基苯酚[4-（（1E）-2-（5-（4-hydroxy-3-methoxystyryl-）-1-phenyl-1H-pyrazoyl-3-yl）vinyl） -2-methoxy-phenol），CNB-001]是一种姜黄素化合物，具有亲脂性和穿透血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的药物化 学特性[3]，CNB-001在体外可抑制人 5-脂氧合酶 （5-lipoxygenase，5-LOX）和15-脂氧合酶（15-lipoxygenase，15-LOX），而 5-LOX 在大脑中含量丰富，其产物5-HPETE转化为白三烯，介导炎症和氧化应激[4]。LAPCHAK等[5]在雄性食蟹猴永久性大脑中动脉（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）阻塞中表明在6 h内给予CNB-001治疗，能有效的减少脑梗面积的扩大。但还需进一步在非人灵长类动物模型上评估CNB-001与其他治疗缺血性脑卒中的药物联合作用下的疗效和安全性。

MP-124是聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶 （poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂，有研究显示MP-124在食蟹猴pMCAO和短暂大脑中动脉阻塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）术后 6 h内均表现出明显的神经保护作用，而且无性别差异，也初步探讨了tMCAO术后8 h给予MP-124仍有统计学意义，但其效力低于6 h，MP-124是一种不仅能改善梗死面积，还能改善非人类灵长类动物缺血性卒中模型的神经功能缺损的药物，在tMCAO模型再灌注后PARP被强烈激活[6]。所以MP-124作为PARP的抑制剂更适合与血管再通治疗方式协同应用，减少缺血再灌注带来的进一步损伤，并且MP-124的神经保护作用可持续较长时间。

PSD-95是一种突触支架蛋白，它将N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）与神经毒性信号通路连接起来[7]。NA-1（又称Tat-NR2B9c）是PSD-95抑制剂，通过干预PSD-95的蛋白-蛋白相互作用而发挥作用，COOK等[8]通过MRI、组织学来评估猕猴发生缺血性脑卒中后的神经功能和组织损伤，该研究证明了PSD-95抑制剂对非人灵长类动物大脑的神经保护作用。NA-1是一个非常有潜力的治疗缺血性脑卒中的新药物，目前已进入二期临床试验[9]，临床试验表明NA-1对血管痉挛没有作用，NA-1相关的神经功能改善机制被认为是直接的神经元保护，NA-1尤其对蛛网膜下腔出血后的神经功能改善更显著。

1.2 抗血栓形成的药物 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）是戊糖磷酸途径的代谢产物，是参与细胞内多种合成代谢反应的辅酶和经典分子。外源性NADPH能够阻止缺血/再灌注期间细胞内ROS水平的升高，此外，当有氧时，线粒体可以利用过量的NADPH产生ATP[10]。LI等[11]在雄性恒河猴血栓栓塞大脑中动脉模型的研究上，表明了NADPH可以抑制血小板的聚集，还可以减少10 d后梗死体积。但目前对于该药还只是初步探究，NADPH在非人灵长类动物使用的安全性，有效性等方面还有待深入研究。

第三代噻吩吡啶类抗血小板药物普拉格雷（prasugrel）是P2Y12拮抗剂，有研究[12]提示在食蟹猴血栓性脑卒中模型上使用 1 mg/（kg·d）以及 0.3 mg/（kg·d）的普拉格雷可以减少脑梗死体积，改善神经功能，却不增加出血风险，研究表明，普拉格雷单药治疗对预防血栓性脑卒中是有效的。2016年SUGIDACHI等[13]研究了普拉格雷的活性代谢物R-138727可以增加再灌注的血管再通率，并且普拉格雷抗血小板作用的三期随机非劣效性试验已经在日本完成[14]。相对于氯吡格雷，普拉格雷最主要对标准抗血小板治疗反应不良的患者有效，特别是那些CYP2C19功能下降的患者。

人源抗E/P选择素抗体（humanized anti-E/P-selectin antibody，HuEP5C7）是一种选择性阻断E/P选择素的抗体，选择素在血栓形成中介导白细胞粘附，参与微血管血栓形成，HuEP5C7抑制中性粒细胞与表达E和P选择素的细胞因子激活的内皮细胞的结合，以及P选择素介导的血小板结合。给予HuEP5C7治疗的狒狒不仅可以减少梗死面积、改善神经功能和增加存活率，更重要的是它可以显著抑制外周选择素水平和减少脑中性粒细胞内流。从而减少脑梗死动物的感染风险[15]。

水苏霉小孢子三丙烯基苯酚（stachybotrys microspora triprenyl phenol，SMTP）是一小孢子水霉属真菌的一个小分子家族。SMTP-7是一种有效的SMTP同源物，有研究[16]通过在食蟹猴血栓性脑卒中模型中，注射SMTP-7显著提高了灌注后再通率，但SMTP-7对食蟹猴脑卒中模型的疗效不涉及血流动力学改变和凝血抑制，SMTP-7是通过改变纤溶酶原的构象，使其易受内源性纤溶酶原激活剂的蛋白水解激活而发挥作用。SMTP-7作为有潜力的溶栓药需要进一步与rt-PA进行再通和出血性转化比例的比较。SMTP-7能否真正降低出血的风险以及SMTP-7对神经功能缺陷长期预后的影响也都需要再进一步深入研究。

1.3 清除自由基的药物 2-（（（1，1-二甲基乙基）氧化亚氨基）-甲基）-3，5，6-三甲基吡嗪[2-（（（1，1-dimethylethyl）oxidoimino）-methyl）-3，5，6-trimethylpyrazine，TBN]是一种新型的四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP）和硝基酮的合成物，TBN同时具有TMP和硝基酮的药理特性，具有强大清除自由基的功能。TBN很容易穿透血脑屏障，TBN可以有效地进入损伤的脑组织，既抑制Ca2+内流，又清除自由基。有研究[17]证明TBN在雄性食蟹猴脑卒中发生后6 h仍然有效，TBN治疗除能显著减少脑梗死体积外，还可恢复食蟹猴瘫痪手臂的抓食功能。TBN对血小板聚集有边缘作用，与阿司匹林没有协同作用。基于TMP在临床使用中的安全性以及TBN的临床前安全性评价，初步推测TBN在人体是安全的，且副作用小。TBN治疗缺血性脑卒中的临床前疗效有待于临床试验进一步验证。

1.4 其他机制的药物 N-（（3R）-7-（（1R）-1-羟乙基）-3-（4-异丙基苯基）-4，6-二甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基）-3，3-二甲基丁酰胺）[（N-（（3R）-7-（（1R）-1-Hydroxyethyl）-3-（4-isopropylphenyl）-4，6-dimethyl-2，3-dihydro-1-benzofuran-5-yl）-3，3-dimethylbutanamide），TAK-937]是一种选择性高效的大麻素（cannabinoid，CB）受体激动剂，SUZUKI等[18]在猕猴大脑中动脉血栓栓塞模型研究中，证明了TAK-937能够减少梗死体积和脑脊液中s-100β的水平，而且脑脊液中s-100β水平与梗死体积呈正相关。提示s-100β可作为未来TAK-937临床前/临床应用的替代生物标记物。但TAK-937在与人类卒中相关的共病（如高血压和糖尿病）中减少缺血性损伤的能力仍有待证实。

CNTO-0007是含有人脐组织来源细胞 （human umbili cal tissue-derived cells，hUTC）的一种细胞药物，hUTC 包含间充质祖细胞、内皮细胞前体和其他具有广泛增殖能力的未成熟祖细胞，这些细胞可以分化为神经细胞，分泌神经营养因子，并产生细胞因子，如趋化因子、白介素和生长因子，这些因子最终可以调节炎症、血管生成和突触生成，并减少卒中后细胞死亡[19]。MOORE等[20]研究了细胞药物CNTO-0007对恒河猴皮质缺血后功能恢复的影响，结果表明CNTO-0007可以改善恒河猴的精细功能，特别是对抓握功能的影响，但这种恢复的确切机制仍不清楚。该药物仍然需要在非人灵长类动物模型上进行更深入的机制研究。

人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）是胎盘来源的干细胞。hAECs突破了其他干细胞治疗的一些限制，比如免疫排斥反应、肿瘤形成、来源和可用性有限、伦理问题，hAECs可以有效预防卒中后全身免疫抑制，hAECs是一种比许多其他干细胞类型更安全的移植细胞[21]。有研究证明hAECs可以有效地抑制狨猴脑皮质短暂性缺血模型梗死灶的扩大[22]。羊膜上皮细胞疗法已经完成了在缺血性脑卒中的一期临床实验[23]。静脉注射羊膜上皮细胞治疗缺血性脑卒中未来可期。

2 其他非药物疗法

远端缺血后处理（remote ischemic postconditioning，RIPC）是一种非药理学方法，通过间歇性和非侵入性阻断肢体的血流来改善神经功能。有研究[24]表明短期RIPC在恒河猴缺血性脑卒中模型超急性期是安全有效的，RIPC可改善恒河猴脑卒中后30～60 d的神经功能，但对脑梗死体积无影响。与单肢RIPC/四肢RIPC相比，双肢RIPC联合两个训练周期在减少心肌酶、血管内皮损伤和炎症反应方面更有效。考虑到这一点，在卒中超急性期应用双肢RIPC似乎是减少卒中相关的心功能障碍和神经功能缺损的一种有希望的治疗策略。RIPC具有无创，成本低，使用方便的特点，希望有条件可以进一步对其深入研究。

SHIMIZU等[25]首次报高了经颅靶向-低频超声溶栓（transcranial targeting-low frequency ultrasound thrombolysis，TCT-LoFUT）在食蟹猴以及恒河猴正常大脑中的临床前安全性检测。通过组织学证据支持TCT-LoFUT没有对健康的非人灵长类动物造成大脑肿胀、坏死等不良影响。TCT-LoFUT无创，且同时可以达到诊断与治疗缺血性脑卒中的目的，但是在不正确的声学条件下使用它可能会导致严重的脑损伤。所以TCT-LoFUT在非人灵长类动物的安全性研究还需继续。

3 小结

缺血性脑卒中是一种简单而明确的病理状态，血流中断导致组织连续损伤，另一方面，缺血性脑卒中又是一种高度复杂的疾病[26]。许多临床前研究绝大多数临床前研究都失败了，原因包括神经保护药物只在年轻动物身上进行测试，这并不能模拟老年人类中风的所有方面，同时啮齿类动物在解剖学，遗传学，病理生理等各方面都与人类相差甚远，还包括卒中模型只是单纯的卒中，但是临床上的卒中通常会合并高血压，糖尿病等其他疾病。这些可能都是导致在动物模型上有很好的疗效，但在临床前试验总是失败的原因[27]。所以非人灵长类动物缺血性脑卒中模型是特别有价值的工具。本文总结了到目前为止以非人灵长类动物为模型的缺血性脑卒中的一些药物以及非药物治疗研究，它们治疗缺血性脑卒中各有利弊，但研究并不全面，想要应用到临床试验阶段还需要对它们进行深入研究。建议在非人灵长类动物模型上建立共病的卒中模型，将这些神经保护药物与溶栓药物相结合，评价这些药物的疗效以及安全性。同时，非人灵长类动物作为研究对象，成本昂贵，造模技术要求高，动物护理还需要专业人员支持，希望有能力有资源的研究者们能突破难关，在未来的缺血性脑卒中的临床研究中能有重大突破。