新生儿及产妇感染单核细胞增生李斯特菌分离株的血清型、耐药性及分子特征研究

王双杰，岑贞娇，吕素玲，曾尚娟，阮佳玲，李颖丰

1. 广西壮族自治区妇幼保健院检验科，广西壮族自治区 南宁 530002； 2. 广西壮族自治区疾病预防控制中心， 广西壮族自治区 南宁 530028

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)可引起人畜共患李斯特菌病[1]，尤其是在孕产妇、新生儿、老年人和免疫功能低下者中可引起严重的侵袭性疾病，死亡率高达 20%～30%[2-4]。Lm为兼性胞内寄生菌，广泛存在于自然界，如水、土壤、腐败植物等。Lm能在0～45 ℃环境中生长，具有较强的耐干冷环境特性，易污染食品加工环境，导致食物污染引起人、畜感染，已成为重要的威胁食品安全的食源性致病菌[5-6]。Lm可引起孕产妇宫内感染导致流产、早产及死胎[7]，其主要通过胎盘垂直传播或吸入污染的羊水引起新生儿严重感染。目前，国内关于孕产妇感染Lm导致新生儿感染的病例不断被报道，提示孕产妇及新生儿Lm感染正在增加，且致死率升高[8-9]。当前针对新生儿Lm感染的发病率、临床分离株分子流行病学特点及临床特征的研究尚缺乏，本研究回顾性收集分析2015—2017年广西壮族自治区妇幼保健院从新生儿科及产科送检的血液、羊水、宫颈分泌物及耳拭子标本中分离的Lm毒株资料，对分离株进行体外抗生素药物敏感试验、血清学分型及多位点序列分型 (multilocus sequence typing，MLST)后做进一步分析，拟从药物敏感性、血清型和基因遗传背景角度为Lm的临床诊治提供更多的流行病学信息。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

临床分离菌株：分别从新生儿科患儿送检的血液、耳拭子标本，以及从产科送检的患儿母亲血液、宫颈分泌物、羊水标本中分离培养Lm。在哥伦比亚血琼脂平板上挑取呈现β-溶血环的菌落单克隆置于菌种保存管中，储存在-80 ℃低温冰箱备用。

1.2 实验菌株的鉴定及体外药物敏感性试验

菌株鉴定：使用革兰阳性菌鉴定卡片GP鉴定卡(法国生物梅里埃公司)，严格按照厂家操作说明对所分离菌进行鉴定。

体外药物敏感性试验：采用Lm微量肉汤稀释法药敏试剂盒(上海星佰生物技术有限公司)，严格按照厂家操作说明对所分离的Lm进行药敏试验：挑取数个新鲜菌落，用灭菌生理盐水制成0.5麦氏单位的菌悬液后，吸取菌悬液60 μL，加至营养肉汤培养液中(12 mL)。按说明书要求，加入600 μL无菌马血清，完全混匀。用微量移液器吸取稀释菌液100 μL，加至除阴性对照孔外的微量药敏板中，阴性对照孔加入100 μL无菌营养肉汤培养液。放入恒温培养箱中35 ℃培养20～24 h。根据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)关于Lm抗微生物药物敏感性试验的要求，选择青霉素、氨苄西林、复方新诺明及美罗培南等药物进行测试。药敏试验结果判断参照不常见菌和苛氧菌药物敏感性试验解释标准[10]执行。

1.3 血清学分型

Lm的血清型由O抗原和H抗原共同决定。参照Lm诊断血清使用说明书，O抗原检测采用玻片凝集法，H抗原检测采用试管凝集法。所用试剂盒来自日本生研(Denka Seiken公司，日本)。结果判断参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《单核细胞增生李斯特菌血清分型方法》[11]。

1.4 Lm的MLST检测

1.4.1Lm总DNA提取采用lysis buffer for microorganism to direct PCR试剂盒(大连TaKaRa公司，Code No.9164)提取菌株DNA，同时采用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo Scientific公司，美国)测定DNA浓度并于-20 ℃保存备用。

1.4.2Lm的MLST分析将所分离的Lm进行MLST分析。查阅相关文献[12]可知，所使用的Lm的7对管家基因分别为abcZ，bglA，cat，dapE，dat，ldh及lhkA；引物序列均摘自Institut Pasteur在线数据库(http://bigsdb.pasteur.fr/index.html)，具体如表1所示。

表1 Lm的MLST分型中7对管家基因引物序列

1.4.3 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增产物分析采用50 μL PCR体系：6 μL DNA模板，正、反向引物各2 μL，25 μL Taq PCR MasterMix [天根生化科技(北京)有限公司]，15 μL H2O。PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，52 ℃(bglA为45 ℃)退火30 s，72 ℃ 延伸2 min，35个循环；72 ℃终末延伸 10 min。PCR产物经电泳验证后，送至广州艾基生物技术有限公司测序。使用Chormas软件查看编辑DNA峰形图，评估测序结果质量。将所得到的Lm7对管家基因测序结果提交至LmMLST数据库(http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html)中进行分析，确定各个管家基因的等位基因数值，与已公布的Lm7对管家基因的等位基因进行比较，进而确定Lm临床分离株的序列分型(sequence type，ST)。

2 结果

2.1 临床感染Lm情况分析

从2015年1月—2017年12月广西妇幼保健院新生儿科及产科送检的血液、羊水、宫颈分泌物及耳拭子标本中共分离培养出6株Lm，分别命名为Lm1～Lm6。其中Lm1、Lm2及Lm6从新生儿血标本中分离获得，Lm3和Lm4分别从患儿母亲(病例2)羊水及宫颈分泌物标本中分离获得，Lm5从新生儿(病例2)耳拭子标本中分离获得(表2)。期间共计 32 864 例活产儿纳入本研究，新生儿Lm发病率为0.091‰(3/32 864)，2例患儿最终放弃治疗死亡，死亡率高达66.7%(2/3)。其中血培养检出Lm的2例患儿(病例1及病例2)，均因宫内感染导致胎儿窘迫，行剖宫产娩出，为早产(<32周)低出生体重儿(出生体重<2 500 g)，出生后均出现呼吸困难、气促、呼吸不规则，可见三凹征，两肺呼吸音粗；1例患儿(病例6)顺产娩出，出生后出现呼吸困难、气促、呻吟、少许红色血性痰、指端凉以及心率、血氧下降等重度窒息症状(见表2)。

患儿的母亲主要表现为呼吸系统症状、全身酸痛、乏力、急性发热等似流感样轻度症状，同时伴有胎膜早破、先兆早产、胎儿窘迫等宫内感染症状，流行病学调查显示均存在不洁净饮食史，近期食用过易被Lm污染的食物如冰淇淋、生冷食物、凉拌菜及蔬菜沙拉等，这些均增加了感染的风险(见表2)。

表2 侵袭性Lm感染患儿及其母亲的流行病学特征

2.2 分离株药物敏感性试验及血清学分型

Lm药物敏感性试验结果显示，分离株对CLSI M45推荐检测的4种抗菌药物均100%敏感。最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)分别为青霉素0.5 μg/mL、氨苄西林 0.25 μg/mL、复方新诺明0.015/0.3 μg/mL及美罗培南0.125 μg/mL。

血清凝集试验检测发现，Lm分离株分属2个血清型，分别为4b(5株)和1/2a(1株)。其中4b是分离率最高的血清型，占83.3%(5/6)；其次是1/2a，占16.7%(1/6)(见表2)。

2.3 MLST分型结果

按照Institut Pasteur MLST官网(http://bigsdb.pasteur.fr/)提供的特异性引物序列合成引物，经过特定的PCR体系扩增后，得到Lm的7对管家基因abcZ，bglA，cat，dapE，dat，ldh及lhkA的特异性PCR产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳可见各个管家基因清晰特异的目的条带，且阴性无污染，无明显二聚体。

将Lm分离株的7个管家基因等位基因数值提交至MLST数据库以获取对应的ST值。ST结果显示，临床所分离的Lm分为2个不同的ST型，对照数据库中的序列分型结果均能找到相同等位基因数值排列，即均为已知的ST型(见表2)。Lm的MLST分析定义7个管家基因的等位基因型中，拥有5个以上相同等位基因型的菌株组成一个克隆复合物(clonal complex，CC)[13]。在确定ST的基础上应用Institut Pasteur MLST数据库对分离的菌株进行同源性分析，结果显示，所分离的6株Lm可分为2个ST型(ST-1和ST-20)，ST-1属于CC1克隆复合物，ST-20属于CC20克隆复合物。

3 讨论

李斯特菌病具有低致病率和高致死性的特点。据统计，国外新生儿李斯特菌病发病率为0.52‰[14]，死亡率达20%～30%[15]。孕产妇感染Lm致流产及早产的发生率为2.4‰～5.5‰，与种族、饮食习惯及社会经济状况等有关[16-18]。目前，国内同类研究报道较少，本研究针对新生儿Lm感染的发病率及临床分离株的血清型、耐药性及分子特征进行研究，同时分析总结患儿及其母亲的临床特征。结果显示，广西南宁地区新生儿李斯特菌病发病率为0.091‰(3/32 864)，低于国外水平，可能与我国以熟食为主的饮食习惯有较大关系。本研究统计发现该地区新生儿感染Lm的死亡率高达66.7%(2/3)，远高于其他地区水平。其中3例(病例1、病例2及病例6)患儿均为败血症且于出生后24 h内发病(早发型感染，即出生后6 d内发病)，患儿母亲均有宫内感染指征，提示大多数早发型感染在子宫内即发病。这3例早发型感染患儿(患儿出生后不久均出现呼吸困难、气促、发绀)均发生严重的败血症合并化脓性脑膜炎，最终1例(病例1)患儿治愈出院，2例(病例2及病例6)患儿因感染严重而放弃治疗。国内外因孕产妇感染Lm导致新生儿败血症及化脓性脑膜炎死亡的病例不断有报道[19]，且有上升趋势。李斯特菌病多为散发病例，且潜伏期较长，大多数情况下呈隐性感染，无明显特异性症状[20]。本研究中3例患儿母亲的临床症状均不典型，具体表现为呼吸道感染(似流感样)、产前发热、宫内感染、胎膜早破及C反应蛋白显著持续升高等)，疾病预防控制中心(简称“疾控中心”)流行病学调查显示均有不良饮食因素如凉食及生食蔬菜、水果史，增加了感染Lm的风险。以上资料提示临床医师面对孕晚期产妇出现急性发热、腹痛、羊水浑浊及轻度流感样等症状时，应重视排查其感染Lm的可能性，从而进行病原学检查，做到早期诊断与及时治疗，可降低新生儿感染发生。

Lm通常对青霉素、氨苄西林、复方新诺明及美罗培南等抗生素敏感。本研究结果显示，所有分离的Lm对上述4种抗生素的敏感率均为100%，暂未发现该地区有耐药菌株。需要特别注意该菌对头孢菌素天然耐药，而临床针对感染Lm孕产妇的标准治疗方案多为头孢菌素。本研究中1例患儿(病例6)胎龄37周，Apgar评分2-2-4，出生体重 2 700 g，C反应蛋白66.22 mg/L，在当地医院未明确病原菌前经验性使用头孢他啶抗感染，转至广西壮族自治区妇幼保健院后，病情严重，予美罗培南+氨苄西林舒巴坦抗感染，但最终因病情危重放弃治疗。

Lm目前可分为13个血清型，而引起人类感染的90%血清型[21-22]为1/2a、1/2b和4b，均具有较强的致病性。其中1/2a和1/2b血清型主要引起Lm散发感染，4b血清型主要引起Lm大范围暴发流行[23-24]。本研究结果中新生儿及产妇Lm血清型以4b型为主，占83.3%，血清型1/2b型占16.7%，与国内外相关研究一致[25-27]。结果提示该地区存在可引起暴发流行的血清型别，须加强食源性疾病监测，警惕大范围暴发流行的可能。

MLST是一种基于核酸序列测定的分型方法，可对病原菌生物进化进行分析及对耐药菌株进行追踪[28]。本研究对来源于新生儿血培养及患儿母亲分泌物的6株Lm进行MLST检测分析，ST分型结果显示，临床所分离的6株Lm可分为2个ST型(ST-1和ST-20)，ST-1属于CC1克隆复合物，ST-20属于CC20克隆复合物。同源性分析结果表明广西南宁地区新生儿Lm感染的主要流行菌株为ST-1(83.3%)。在本研究中，分析来自同一新生儿患者(病例2)外周血(Lm2)、耳拭子(Lm3)及其母亲羊水(Lm4)、宫颈分泌物(Lm5)的4株菌，发现其具有相同的药物敏感表型、血清型以及MLST分型，提示新生儿早发型Lm感染源于宫内感染，由母婴垂直传播引起或在分娩过程中新生儿受到产道的病原菌感染。

被Lm感染的孕妇在围生期可有轻微自限性流感样症状、发热、腹痛、呕吐、腹泻、先兆早产等不同表现；新生儿则可表现出发热、气促、皮疹、反应差、呼吸异常、惊厥等，但临床表现缺乏特异性。因此，应高度重视具有高危因素的孕产妇及新生儿，警惕宫内感染的可能，及时给予适当的干预。在未明确病原菌前，临床经验性用药方案多为头孢菌素类抗生素，但须注意Lm对头孢菌素天然耐药。本研究纳入病例数较少，主要原因为目前该地区产Lm感染率较低，但研究内容仍可在一定程度上为临床诊治提供数据支持。实验室检出Lm后，应主动联系临床，并告知疾控中心食源性疾病监测工作组，及时对孕期妇女、新生儿家属进行食品安全宣传教育及流行病学调查，降低妊娠期感染率，减少新生儿李斯特菌病，杜绝Lm感染暴发的可能。

综上所述，临床医师积极采集孕产妇的血液、羊水及宫颈分泌物进行Lm检测，可对部分病例做出早期诊断；胎儿出生时可对血液、脑脊液、胎盘、羊水、皮肤拭子或婴儿的胎粪等标本进行Lm筛查培养，为临床医师明确病因、早期诊断、及时精准治疗、降低病死率提供帮助。