不同严重急性呼吸综合征冠状病毒2抗体检测试剂盒的诊断应用评价

李海聪，王前英，韩伟靖，周毅，曹丹，朱召芹

上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心检验医学科，上海 201508

2020年1月30日，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)宣布严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染所致疫情为国际公共卫生紧急事件[1]。至2021年6月，新冠疫情已扩散至全球，造成超过2亿人感染，450多万人死亡[2]。SARS-CoV-2为β属冠状病毒，基因特征与严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndromes coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)有明显区别[3]。目前，WHO推荐病毒核酸检测[如反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)等方法]为SARS-CoV-2感染确诊的常规手段，但核酸检测对样本采集、样本运输、实验室环境、仪器设备和操作人员均有较高的要求[4-5]。

国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组在2021年5月11日发布的《新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)》中指出，SARS-CoV-2血清特异性IgM抗体和IgG抗体的检测可作为确诊病例和无症状感染者的血清学证据，也可用于排除疑似病例[6]。血清学检测可作为核酸检测的补充手段。已有文献报道，发病约3周后，SARS-CoV-2感染者体内的IgG和IgM血清学转换率可分别达到100%和73.7%[7]。国内一些体外诊断试剂生产公司已陆续开发出SARS-CoV-2抗体免疫检测试剂。为了对SARS-CoV-2血清学诊断方法进行验证，本研究选取6个品牌的SARS-CoV-2抗体检测试剂盒进行临床灵敏度和特异性的评估，期望为SARS-CoV-2的临床诊断提供数据，为临床工作者提供参考。

1 对象和方法

1.1 标本来源

收集2020年1月30日-5月11日在上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心的住院患者血清245例，其中122例SARS-CoV-2感染确诊患者(SARS-CoV-2核酸检测阳性)作为病例组，包含男性67例(年龄34.09±16.79岁)和女性55例(年龄 31.21±12.11岁)；其余123例为排除SARS-CoV-2感染的其他疾病患者，作为对照组，包含男性77例(年龄47.73±21.51岁)和女性46例(年龄46.40±18.95岁)，其中肺部感染28例，发热9例，肺结核8例，肝炎7例及糖尿病、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染等其他疾病71例。

本研究为回顾性研究，经上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心医学伦理委员会审查批准(公卫伦审[2020]YJ-2020-S80-02-01号)，符合《赫尔辛基宣言》原则。

1.2 试剂与仪器

本研究选择6个品牌的SARS-CoV-2抗体检测试剂盒，其中3个试剂盒为胶体金法(POCT)，另外3个试剂盒为基于化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)平台；2个试剂盒检测抗SARS-CoV-2总抗体，其余4个试剂盒分别检测SARS-CoV-2特异性IgG和IgM抗体。将选用的6个试剂公司生产的SARS-CoV-2抗体检测试剂盒依次编号为A，B，C，D，E，F。A为SARS-CoV-2抗体检测试剂盒(胶体金法，试剂批号为W19500209)；B为SARS-CoV-2 IgG/IgM抗体检测试剂盒(胶体金法，试剂批号为20200311，20200404)；C为SARS-CoV-2 IgG/IgM抗体检测试剂盒(胶体金法，试剂批号为2004080410)；D为SARS-CoV-2抗体检测试剂盒(磁微粒CLIA，试剂批号为20200417，仪器为Caris 200)；E为SARS-CoV-2 IgG抗体测定试剂盒和SARS-CoV-2 IgM抗体测定试剂盒(CLIA，试剂批号为20200101，20200202，仪器为iFlash3000)；F为SARS-CoV-2 IgG抗体检测试剂盒和SARS-CoV-2 IgM抗体检测试剂盒(CLIA，试剂批号为20200425，仪器为AE-180)。

1.3 SARS-CoV-2抗体检测

使用编号为A，B，C，D，E，F的6个SARS-CoV-2抗体检测试剂盒，分别对245例住院患者的血清进行抗体检测，并分析其临床灵敏度、临床特异性、阳性预测值(positive predictive value，PPV)和阴性预测值(negative predictive value，NPV)等指标。所有操作均严格按照仪器和试剂盒说明书进行。

1.4 SARS-CoV-2核酸检测

采用PCR方法对245例住院患者的咽拭子进行核酸检测。所有操作均严格按照仪器和试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法

采用 Wilson得分方法计算95%置信区间，采用 McNemar’s Test(配对卡方检验)对血清学检测结果与核酸检测结果进行统计学分析，P<0.05代表有统计学差异。应用GraphPad对数据进行作图并分析。

2 结果

2.1 试剂盒临床特异性和临床灵敏度比较

以病例组122例经核酸检测证实为SARS-CoV-2感染的患者和对照组123例排除SARS-CoV-2感染的其他疾病患者为检测对象，胶体金试剂和CLIA试剂检测的临床特异性和敏感性结果如表1所示。结果显示，各品牌试剂的临床灵敏度表现差异较大，使用胶体金法的试剂盒中，A试剂、C试剂(IgG+IgM)和B试剂(IgG+IgM)的灵敏度分别为84.4%、59.8%和55.7%；使用CLIA的试剂盒中，D试剂、E试剂(IgG+IgM)和F试剂(IgG+IgM)的灵敏度分别为85.2%、72.1%和77.9%。CLIA的阳性检出率整体高于胶体金法。在区分SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测试剂的结果中，IgG抗体的检出率均高于或等于IgM，但并非所有IgM阳性的样本都可检出IgG阳性。IgG和IgM联合检测的灵敏度均高于单独检测IgG或IgM。

表1 各试剂临床特异性和临床灵敏度比较(n=245)

在对照组的假阳性样本中，1例患者C试剂IgG、D试剂总抗体、F试剂IgG的检测结果均为阳性，此患者为男性，67岁，临床诊断为结核性气胸，经证实阳性；另有15例样本的某一试剂检测结果为阳性。IgM检测的特异性略高于IgG。

2.2 血清学检测与核酸检测比较

依据阳性预测值，得出阳性检测的样本中，SARS-CoV-2感染患者占阳性检测样本总数的88.9%～100%(见表2)。依据阴性预测值，得出阴性检测的样本中，正常样本占阴性检测样本总数的 53.7%～87.1%(见表2)。

表2 各试剂阳性预测值和阴性预测值

胶体金检测试剂中，A试剂总抗体、B试剂(IgG+IgM)、C试剂(IgG+IgM)与核酸诊断的符合率分别为91.4%、77.6%和79.2%。经 McNemar’s Test检验，χ2值分别为12.19、49.16和41.49，且P<0.05，与核酸诊断的差异具有统计学意义。

CLIA试剂中，D试剂、E试剂(IgG+IgM)和F试剂(IgG+IgM)与核酸诊断的符合率分别为91.8%、81.6%和87.8%，经 McNemar’s Test检验，χ2值分别为11.25、10.76和17.63，P<0.05，与核酸诊断的差异有统计学意义。

2.3 血清学检测与核酸检测确诊时间

为分析感染后不同阶段血清学总抗体(IgG+IgM)的检测结果，将病例组所有样本根据核酸检测确诊后的天数分为3组：≤7 d、8～15 d和≥16 d。3组的灵敏度分别为31%～66%、61%～91%和70%～96%，所有评估试剂的阳性检出率均随时间上升(见表3、图1)。区分IgG和IgM检测的试剂也根据时间进行了统计(见表3，图2)，其中F试剂对IgG的检测表现最优，≥16 d组的灵敏度为96%。

表3 各试剂在各病程标本检测中的敏感性比较(n=122)

注：根据核酸确诊时间将患者进行分组：≤7 d, 8～15 d, ≥16 d。

注：根据核酸确诊时间将患者进行分组：≤7 d, 8～15 d, ≥16 d。

2.4 各试剂间检测结果符合率

尽管一些试剂的临床灵敏度表现相近，但对于病例组中的单个样本，各试剂的检测结果并不一定相同，所有试剂检测结果一致的样本仅占55.7%(68/122)。此外，有14例样本所有试剂均未检出阳性。

分析病例组样本所有试剂检测的结果，并对其符合率进行统计，具体结果如表4所示。其中，D试剂与A试剂、D试剂与F试剂的符合率最高，分别为93.4%和91.0%。CLIA试剂之间的符合率均达到85%以上，胶体金试剂之间的符合率平均值为77%，比CLIA试剂略低。

表4 各试剂对病例组检测结果的符合率

3 讨论

中华人民共和国国家卫生健康委员会在2020年3月3日印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中，首次将血清抗体检测阳性作为SARS-CoV-2感染的临床特点(实验室检查)和诊断标准[8]。目前国内已有多家诊断试剂公司基于免疫学检测紧急开发出SARS-CoV-2抗体检测试剂。因此，有必要对抗体检测试剂的性能进行充分评估，从而为血清学检测在临床诊断、病例追踪和流行病学调查中发挥辅助作用提供数据支持。本研究选取A试剂、B试剂、C试剂(这3个试剂为胶体金法)和D试剂、E试剂、F试剂(此3个试剂为CLIA)6个品牌的检测试剂，主要对其临床灵敏度、临床特异性等指标进行评估。胶体金免疫技术具有实用性强、操作简便快捷等特点，可用于基层医疗机构和现场检测；CLIA具有线性宽、灵敏度高、速度快等特点，可实现自动化的批量检测[9]。

通常情况下，病毒进入人体后，机体免疫系统会产生相应的特异性抗体进行防御。IgM在病毒感染早期首先出现，持续时间较短，因此可作为急性感染的标志。相反，IgG出现时间晚于IgM，但持续时间长，感染清除后仍可维持在较高水平，IgG阳性代表机体处于感染恢复期或既往感染。有研究结果显示，在SARS-CoV-2感染后的最初2周内，血清学转换率和抗体水平快速增长，累积阳转率在感染后11 d可达50%，感染后39 d可达100%[10]。本文研究结果显示，IgG和IgM的检出率均随时间而上升，在核酸检测确诊7 d内，IgM的灵敏度仅为10%～28%，而IgG显著高于IgM，为28%～45%。根据核酸检测时间分组，在核酸检测确诊时一些患者可能已发病一段时间，进入感染中期或恢复期，因此IgM的检出率低于IgG；亦有文献报道，有22%核酸检测确诊阳性患者IgM为阴性[11]。当核酸检测确诊时间>16 d，IgG灵敏度最高可达96%，此时IgM并未消失，阳性检出率最高可至83%。因此，在临床应用中推荐使用IgG和IgM联合测试，有助于提高检测的灵敏度。

对照组样本检测中，各品牌试剂盒临床特异性为91.1%～100%。其中，D试剂的临床特异性为98.4%，略低于其说明书的100%临床特异性；E试剂IgG和IgM抗体检测试剂的临床特异性分别为92.7%和98.4%，与其他文献报道的92.41%和96.20%相近[12]。抗体检测产生的假阳性可能与其所使用的抗原有关，也可能来自样本中的异嗜性抗体、自身抗体等物质的干扰，或检测试剂对于其他非SARS-CoV-2产生的抗体有交叉反应。方法学的差异也可能会导致假阳性，与总抗体检测使用的双抗原夹心法不同，IgG和IgM检测通常采用间接法或捕获法，试剂中使用的抗IgG/IgM二抗与待测抗体的结合为非特异性反应，因此更容易导致假阳性产生。在病例组样本的检测中，试剂间表现差异较大，临床灵敏度为13.1%～85.2%，样本用量、方法学和原料的差异可能是导致灵敏度差异的原因。D试剂总抗体检测采用双抗原夹心法，样本无需稀释，因此灵敏度更高；其他试剂盒均采用间接法或捕获法检测IgG/IgM抗体，样本需要稀释使用。此外，CLIA试剂在方法学上占有一定的优势，整体阳性检出率相较胶体金法更高，CLIA是以磁微粒为固相载体的液相反应，反应面积更大、反应更为充分，可更高效地捕获待测抗体，因此灵敏度更高。病例组中有14例样本在所有试剂检测中均未获得阳性结果，这可能是由病毒感染时间较短，患者体内还未产生抗体或抗体滴度较低造成的；也可能是由于年龄、药物、免疫抑制等原因，患者的免疫系统无法对病毒感染产生应答，这种情况在其他文献中也有报道[13]。

对于单个SARS-CoV-2确诊样本来说，不同品牌试剂间可能会产生不同的检测结果。与SARS-CoV抗体检测试剂类似，SARS-CoV-2抗体检测试剂通常使用刺突蛋白(spike protein，S蛋白，主要暴露在病毒表面)和核衣壳蛋白(nucleocapsid，N蛋白，在病毒感染过程中大量表达)作为特异性抗原[14-15]。此外，包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)和位于S蛋白S1亚基的受体结合位点(receptor binding sites, RBSs)也用于SARS-CoV-2抗体检测[14-15]。D试剂总抗体检测使用RBD蛋白(S蛋白的受体结合位点)[16]，B试剂IgG和IgM检测使用N、S蛋白[17]，C试剂IgG和IgM检测使用N蛋白[18]，E试剂抗体检测使用N蛋白和E蛋白[11]。有文献统计，使用S蛋白的检测试剂灵敏度高于N蛋白，且使用S蛋白的检测试剂灵敏度最高可达93.5%，而单独使用N蛋白的检测试剂灵敏度最高仅为80.8%[18]。本文的研究结果也显示，使用RBD蛋白的D试剂阳性检出率略高于使用N、E蛋白的E试剂，这可能是由于人体对于S蛋白有更强的敏感性和更早的免疫应答。

SARS-CoV-2核酸检测具有局限性，血清学检测可作为一种有效的检测方法用来辅助诊断，也可作为筛查和流行病学调查的手段。不同品牌试剂的性能表现有差异，应根据使用场景和临床需求选择合适的试剂盒。