一例牛结节性皮肤病的诊断与防治

马 龙，李 莉，王玉梅，尹 才，李 杰，王晓亮，李知新

（宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，宁夏 银川 750000）

1 流行概况

A场存栏奶牛4 650头，2020年8月28日引进奶牛420头。据该场技术人员反映，2020年10月20日，该批牛体表皮肤陆续出现丘疹、破溃、结痂等症状。10月22日，1头牛因后肢损伤严重死亡。10月31日，对该场引进奶牛按山羊的5倍剂量，免疫吉林和元生物工程有限公司山羊痘活疫苗。经调查，目前该批调入牛有20%左右表现出疑似牛结节性皮肤病临床症状。

B场存栏奶牛1 427头，2020年10月16日引进奶牛197头（该批牛起运时共200头，运输途中死亡3头）。据调查，该批奶牛入场后发现有个别牛体表皮肤出现数量不等的小丘疹。10月27日，对该场所有奶牛按山羊的5倍剂量，全部免疫金宇保灵生物药品有限公司山羊痘活疫苗。

C场存栏奶牛1 146头，2020年10月13日引进奶牛420头。入场时，个别牛皮肤上有丘疹，但没有引起足够关注。

2 临床症状

患病奶牛精神沉郁，不愿活动；食欲减退，流泪流涎；体温升高，发热后皮肤出现10～50 mm的结节，通常均匀分布在全身；病变部位出现溃疡，吸引蝇蚊，反复结痂。结痂附近有明显炎症，皮肤组织有出血性渗出液，呈黄色。

3 实验室检测

3.1 材料

单道微量移液器和多道微量移液器（Eppendorf公司）；IQ5高速荧光定量PCR仪（美国伯乐BIO-RAD公司）；一次性移液器吸头（Axygen公司）；牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒、引物探针由青岛立见诊断技术发展中心提供；核酸提取试剂盒（磁珠法）购自苏州天隆生物科技有限公司（批号20082510T014）。

3.2 样品采集 采集疑似发病牛只破溃结痂组织、口鼻拭子样品15份，利用荧光PCR方法检测牛结节性皮肤病病毒（LSDV）。

3.3 检测方法

3.3.1 样品处理 采集疑似发病牛只组织样品，取少许加入石英砂，充分研磨，加入pH7.4 PBS缓冲液，制成1∶5～1∶10悬液，反复冻融3次，8 000 rpm离心2 min，取上清液56℃水浴消化1 h备用，作为PCR试验材料。

3.3.2 DNA提取 病毒总DNA按照苏州天隆生物科技有限公司试剂盒说明书提取。对疑似发病牛只及同群牛进行牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测。

3.3.3 基因扩增 将引物探针和酶反应液瞬时离心后，将酶反应液全部移至引物探针中，颠倒混匀6次，充分混匀，配制成PCR反应液。

根据检测样品数量，每个PCR反应管加入20 μlPCR反应液；先取5 μl阴性对照、再取5 μl待检DNA、最后取5 μl阳性对照（充分混匀）分别加到不同的PCR反应管中，加样结束后盖紧PCR反应管。荧光PCR反应条件为50℃预变性2 min；95℃变性5 min；95℃变性15 s，58℃延伸60 s，共40个循环。设置58℃收集FAM荧光信号。

4 结果

对疑似患病牛只采集样品进行牛结节性皮肤病病毒核酸荧光PCR检测，得到特异性扩增曲线，且CT值≤37，阴性对照无特异性扩增曲线。综合临床表现、病理特征以及荧光PCR检测结果，确定患病牛只感染牛结节性皮肤病病毒。

5 措施及建议

一是检测扑杀。对3个牛场调入牛逐头采样检测，对所有发病和病原学阳性牛实施扑杀和无害化处理。二是封锁隔离。对3个牛场实施封锁30 d，严格禁止牛只移动[1]。同群病原学阴性牛严格进行隔离饲养，全场牛按山羊的5倍剂量紧急免疫接种山羊痘活疫苗。三是消毒处理。对全场饲养环境、圈舍、场地、器具、交通工具等进行严格彻底消毒。四是疫情报送。将阳性样品送国家外来动物疫病研究中心复核确诊，并向中国动物疫病预防控制中心报告疫情。同时，要求各级动物疫病预防控制机构对辖区内新引入牛只（奶牛、牧牛）开展排查摸底监测，并实行日报告制度。五是免疫接种。建议所有奶牛场（牧场）自行采购山羊痘活疫苗进行免疫接种。六是检疫监管。要求各地强化调入牛只检疫监管，重点对牛结节性皮肤病进行临床症状的查验和病原学监测[2-4]。七是宣传培训。强化动物疫情应急值守，密切关注疫情动态，加强宣传培训。