基于网络药理学分析“人参-鹿茸”药对治疗阿尔茨海默症的作用机制

张楠茜，李春楠，吕经纬，高晓晨，张龄予，张 辉，孙佳明

（长春中医药大学，长春 130117）

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）作为一种中枢神经系统退行性疾病，其患者通常出现记忆功能减退、语言障碍、时间定向力障碍等症状，目前已严重威胁到老年人的健康及生活[1]。中医理论认为，气血亏虚、营卫不和、五脏失衡可致神明受损、脑髓空虚、神失所养，进而导致老年痴呆。人参味甘而微苦，微温不燥，功善大补元气，养血生津，广益五脏，为“治虚劳内伤之第一要药”[2]；鹿茸味甘咸性温，《本草纲目》载曰：“生精补髓，养血益阳，强健筋骨”。二者一擅补益元气，一能补肾益精，合用则阳得阴助，阴得阳化，养阴补髓、填精充脑。据文献报道较多改善记忆功能的方剂均含有人参、鹿茸，故将“人参-鹿茸”配伍，可精简组分，提高其药效。

中药网络药理学是建立在高通量组学数据分析、计算机虚拟计算及网络数据库检索等技术基础上的一种新方法，因其具有整体性和系统性的优势，现已广泛应用于中药复方及单味药的作用机制研究中[3-4]。介于“人参-鹿茸”化学成分复杂且用于治疗阿尔茨海默症的作用机制尚不明确，本文利用网络药理学“多成分-多靶点-多途径”的特点通过网络分析方法筛选出人参和鹿茸中的潜在活性成分及相关靶点，并构建药物分子靶点-疾病之间的协同作用关系，最后系统解析药对间的相互作用关系，为深入研究“人参-鹿茸”药对治疗阿尔茨海默症提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 建立人参-鹿茸化学成分数据库 利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php）及中药分子机制生物信息学分析平台（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）挖掘人参、鹿茸相应化学成分。同时，还从TCMSP 数据库获得了7 种重要的药理学相关性数据，包括分子量（MW），脂水分配系数（AlogP），氢键供体数（Hdon），氢键受体数（Hacc），生物利用度（OB），药物细胞穿透性（Caco-2），类药性（DL）。

1.2 有效成分筛选 以利宾斯基五法则（ADME）为理论依据，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及类药性指数（drug-like lndex，DL）≥0.18 为指标对人参、鹿茸中的有效成分进行筛选。同时满足OB ≥30%，DL ≥0.18 这2 个标准的有效成分可进行下一步分析。同时，利用Google Scholar 进行大规模的文本挖掘，将含量高或活性强的化合物也归入有效成分库中。

1.3 靶点预测 首先，将有效成分导入Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch），通过2D 和3D 结构相似性预测有效成分的靶点。在 TTD 数据库中输入“Alzheimer”关键词搜索与阿尔茨海默症相关的靶点，所得靶点即为阿尔茨海默症靶点。将有效成分与阿尔茨海默症相关的靶点进行映射，可得 “人参与鹿茸”与阿尔茨海默症进行相互作用的核心靶点，同时使用蛋白质数据库（uniprot database）选择物种为“homo sapiens（human）”的靶点,将靶点名称和基因名称进行转换。

1.4 GO 生物过程注释富集及KEGG 信号通路分析利用 Cytoscape 软件中的“ClueGO”插件对的核心靶点进行 GO（gene ontology）生物过程注释富集，建立 GO 生物过程注释层级关系图，分析核心靶点在体内强有效性的生物过程注释。KEGG 信号通路分析利用Metascape数据库（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）将核心靶点进行KEGG（kyoto encyclopedia of genesand genomes）信号通路富集，物种与背景设置均为“homo sapiens”（智人），研究关键靶点投射的 KEGG 信号通路与疾病之间的相互关系，明确可能的药理机制。

1.5 网络构建 构建两个网络：1）成分-靶点网络（CT 网络），将 “人参-鹿茸”有效成分与其相应的靶点构建CT 网络；2）成分-靶点-通路网络（CTP网络），建立由成分、靶点及其相应通路组成的CTP网络。所有可视化网络图由Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）构建，利用 Network Analyzer 插件计算 Degree 值，对核心靶点与信号通路间的作用关系进行进一步分析。

1.6 贡献指数计算 为了预测 “人参-鹿茸”中每种有效成分治疗阿尔茨海默症的贡献值，提出了基于成分网络效能（NE）的文献加权贡献指数（CI）计算。

2 结果

2.1 潜在活性成分筛选结果 由于单味药材及中药复方中的成分繁多且复杂，为了得到具有良好药效学和药代动力学特性的有效成分，本研究选择ADME（吸收，分布，代谢和排泄）参数作为筛选指标。利用TCMSP和TCM 在“人参-鹿茸”中共筛选得到230 个化合物，其中人参190 个，鹿茸40 个。以OB ≥30%和DL ≥0.18 为指标进行进一步筛选，最后在“人参-鹿茸”药对中得到29 个具有良好ADME 性质的潜在活性成分。其中人参中包括Stigmasterol、β-Sitosterol、Kaempferol 和Ginsenoside Rh2 等16 个潜在活性成分；鹿茸中包括17-Beta-Estradiol、Glicosamine 和Adenosine Triphosphate 等13 个潜在活性成分。结合文献报道可知，Kaempferol 具有抗炎、抗肿瘤作用[5-6]；FrutinoneA表现出有效的抗细菌和真菌的特性[7]；Adenosine Triphosphate 具有调节突触传递和胶质细胞的作用[8]；Ceramide 可调节细胞分化、增殖、凋亡和衰老等生命活动[9]。

2.2 “人参-鹿茸”治疗阿尔茨海默症靶点预测 目前可用来筛选新药与阿尔茨海默症相关靶点的实验方法有限且耗时较长，故本实验利用计算机模拟的思路来筛选“人参-鹿茸”有效成分和阿尔茨海默症的目标靶点。通过Swiss Target Prediction 数据库和TTD 数据库筛选，映射出40 个“人参-鹿茸”有效成分与阿尔茨海默症相关的靶点，其中排名前5 的目标靶点分别 为muscarinic acetylcholine receptor M2（CHRM2）、acetylcholinesterase（ACHE）、butyrylcholinesterase（BCHE）、peroxisome proliferator-activated receptor gamma（PPARG）、dopamine D2 recepto r（DRD2）。

2.3 抗阿尔茨海默症的生物过程注释及通路分析 为了进一步阐明“人参-鹿茸”与阿尔茨海默症相关靶点的作用机制，利用Cytoscape 软件中的“Clue GO”插件和Metascape 数据库对“人参-鹿茸”治疗阿尔茨海默症的40 个核心靶点进行GO 生物过程注释富集及KEGG 信号通路分析。以P＜0.01 为标准对26 个核心靶点进行GO 生物过程注释富集分析，得到12 个GO 生物过程注释，包括分子功能层面的淀粉样β 蛋白的反应和G 蛋白偶联受体活性，以及细胞组分中的突触传递的负调节和调节突触后膜电位等系列生物过程注释。

在KEGG 通路富集分析中共得到 32 条信号通路，根 据P＜0.01 筛选出排名靠前的9 条信号通路，分别为神经活性配体-受体相互作用（hsa04080）、癌症的途径（hsa05200）、5-羟色胺能突触（hsa04726）、cAMP信号通路（hsa04024）、PI3K-Akt信号通路（hsa04151）、磷脂酶D 信号通路（hsa04072）、味觉转导（hsa04742）、补体和凝血级联（hsa04610）和阿尔茨海默症（hsa05010）。

潘玲珍等[10]研究了长期使用地西泮对小鼠神经活性配体受体相互作用信号通路的影响。通过长期且逐量递增的方式给小鼠连续灌胃地西泮60 d，提取小鼠全脑总mRNA，进行小鼠全基因组芯片检测，运用生物信息学方法筛选出差异表达基因，并通过《京都基因与基因组百科全书》的基因功能通路数据库分析神经活性配体受体相互作用信号通路的变化。结果发现，与正常组比较，地西泮组的神经活性配体受体相互作用信号通路上的16 个基因表达发生了显著性变化，其中表达上调的基因有9 个，表达下调的基因有7 个。其实验结果表明，神经活性配体-受体相互作用信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体配体的集合。

张泓波等[11]通过观察补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马组织环磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）-cREB 反应元件结合蛋白（CREB）信号通路的影响，发现cAMP 信号通路可增强多种靶点基因的表达并增加突触数量，进而提高记忆能力。其将大鼠随机分为补阳还五汤组、尼莫地平组、模型组、假手术组。用改良Pulsinelli’s 四血管阻断法建立血管性痴呆大鼠模型,分别给予相应的药物，连续治疗30 d。利用放射免疫分析法检测海马组织cAMP 含量，Western blotting 法检测PKA 催化亚基（PKAc）蛋白表达，电泳迁移率改变分析法检测CREB 的DNA 结合活性。结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠海马组织cAMP 含量、PKAc 蛋白表达和CREB 的DNA 结合活性均降低（P＜0.01）；与模型组比较，补阳还五汤组和尼莫地平组cAMP 含量、PKAc 蛋白表达和CREB的DNA 结合活性均升高（P＜0.01）。补阳还五汤可增加血管性痴呆大鼠海马cAMP 含量、PKAc 蛋白表达和CREB 的DNA 结合活性，增强cAMP-PKA-CREB信号通路的作用进而起到改善大鼠血管性痴呆的情况。

GABBOUJ S 等[12]研究发现，胰岛素-PI3K-Akt 信号通路在大脑的多种生理功能中起着重要的作用，如代谢、突触形成和细胞生长和存活。基于流行病学、临床和动物模型的研究结果已经建立了T2D 和AD 之间的密切联系，PI3K-Akt 信号的改变是这些疾病的共同点。当磷脂酰肌醇水平降低时，在AD 患者的脑中观察到5-二磷酸3-激酶（PI3K）亚基以及钝的Akt 激酶磷酸化，其特征与β-淀粉样和tau 蛋白现象相似。通过鼻内胰岛素（IN）治疗增强了CNS 中PI3K-Akt信号传导，可改善记忆。已知胰岛素通过PI3K-Akt 信号通路增强神经元生长和突触形成。但是，PI3K-Akt途径在其他细胞类型（如小胶质细胞和星形胶质细胞）中也介导与不同功能相关的信号传导。此外，最近发现有缺陷的Trem2 产生Aβ 噬菌斑的转基因时，小鼠小胶质细胞中的信号传导同时也会导致Akt-mTORC1信号传导受损及AMP 活化蛋白激酶的活化。这导致了自噬体的积累，代谢障碍。此外，小胶质细胞形成周围簇的能力下降Aβ 斑块和营养不良性神经突的形成增加。因此，TREM2-DAP12 信号利用与胰岛素部分相同细胞，通过PI3K-Akt 信号通路诱导其下游效应。由此可见，PI3K-Akt 信号通路可在细胞增殖和分化等方面起到重要作用。

2.4 网络图构建及贡献指数分析 通过Cytoscape 3.7.1 构建“成分-靶点”网络图和“成分-靶点-通路”网络图。“成分-靶点”网络图中包含69个节点（nodes）和214 条边（edges），其中2 个靶点为人参单独作用于阿尔茨海默症，5 个靶点为鹿茸单独作用于阿尔茨海默症，剩余33 个靶点为人参、鹿茸共同作用于阿尔茨海默症，这说明 “人参-鹿茸”配伍可起到协同作用于阿尔茨海默症的效果。“成分-靶点-通路”网络图中包括78 个节点（Nodes）和284 条边（Nodes），其中有9 个节点为KEGG 通路富集中得到排名靠前的9 条重要通路，人参和鹿茸通过40 个靶点协同作用于重要通路中。

网络中的高度互联源于各节点的高值，结合文献加权的网络功效提出了每个有效成分的贡献指数，根据计算结果所示，“人参-鹿茸”中17-Beta-Estradio（LR-1）、Adenosine Triphosphate（LR-3）、Retinol（LR-8）、Kaempferol（RS-3）、Ginsenoside Rb1（RS-16）和Panaxadiol（RS-12）6 个有效成分对治疗阿尔茨海默症的贡献最大，置信区间（confidence interval，CI）值为87.13%。因此，以上6 个有效成分为 “人参-鹿茸”药对治疗阿尔茨海默症的主要物质基础。

3 讨论

人参和鹿茸皆为名贵中药，被历代医家所选用，基于二者“扶正固本，生精益血”的特性，常被组成具有调神养身、益智抗衰功效的方剂。目前人口老龄化问题较为严峻，阿尔茨海默症作为一种严重影响中老年人工作和生活的疾病，已引起生物医学界的广泛关注。由于阿尔茨海默症的致病机制较为复杂，目前对其发病机制尚未明确，故本文从网络药理学“多成分-多靶点-多通路”的角度阐明“人参-鹿茸”在治疗阿尔茨海默症上的分子协同作用。将利用ADME法则筛选出的29个有效成分进行文献加权，结果发现，已有较多文献报道[13-17]人参和鹿茸中的有效成分治疗阿尔茨海默症的生物活性，表明ADME 筛选标准的可信度。通过CTP 网络图可发现，“人参-鹿茸”中的有效成分与阿尔茨海默症相关的核心靶点之间具有密切联系，其中Cholesterol、17-Beta-Estradiol、β-sitosterol和 Kaempferol 等有效成分可通过AChE 靶点作用于cAMP信号通路；Ginsenoside Rb1、Girinimbin、Frutinone A 和Vitamin B1 等有效成分可通过PTRS2 靶点作用到PI3K-Akt 信号通路上，PI3K -AKT 信号通路作为细胞生存信号通路之一，对细胞增殖、分化、抑制神经细胞凋亡均有重要意义。从网络药理学结果可知，“人参-鹿茸”中的三萜类化合物、黄酮类化合物和甾类化合物等药效成分可通过减轻炎症反应、降低乙酰胆碱酯酶活性、通过PI3K-Akt 信号通路抑制 tau 蛋白过度磷酸化，稳定钙离子浓度减少神经元凋亡而发挥治疗阿尔茨海默症的作用，其中AChE 靶点和PI3K-Akt 信号通路在阿尔茨海默症复杂的病理机制网络中起到重要作用，与目前文献[18-19]报道的情况基本相符。

本研究基于网络药理学方法筛选出“人参-鹿茸”药对中治疗阿尔茨海默症的活性成分及相关作用靶点，并进一步建立成分-靶点网络图，分析生物过程注释及信号通路，从系统上研究“人参-鹿茸”药对治疗阿尔茨海默症的内在规律，确定了人参、鹿茸在机体分子层面的核心靶点，阐释了其治疗阿尔茨海默症潜在的物质基础和作用机制，同时也为中药研究阿尔茨海默症复杂的应用提供了参考。