骨质疏松症蛋白质组学研究的进展

刘宝山 张辉 徐又佳

苏州大学附属第二医院骨科、骨质疏松临床中心 苏州大学骨质疏松症诊疗技术研究所，江苏 苏州215004

骨质疏松症(osteoporosis)是一种增龄性骨代谢疾病，其特征是骨密度降低，骨骼脆性和骨折风险增加[1-3]。骨质疏松症主要在50岁以后女性和65岁以后男性中多见[2]；但是，也有研究认为骨质疏松症与多种危险因素和遗传因素密切相关，不过目前仍缺乏有效的预测和预防方法[4]。蛋白质是细胞功能的效应者，与疾病表型的关系比基因或转录更密切；蛋白组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物个体蛋白质组成及其变化的规律。因此，蛋白组学对于识别疾病新的诊断和治疗靶点或监测疾病的进展具有重要作用[5]。

1 生物学标志物和蛋白组学

生物学标志物是生物体受到严重损害之前，在系统、器官、组织、细胞及亚细胞水平发生改变的信号指示物。它可以是细胞分子结构和功能变化，也可以是某一生化代谢过程变化。通过对生物学标志物的测定可了解机体当下所处的生物学过程，对疾病预防、早期诊断和治疗具有积极意义[6]。

蛋白质组学正被众多学科应用，它可以检测正常或疾病状态下组织全部表达蛋白质在量上的差别。早期最常用的是双向电泳技术，后来发展出的非凝胶蛋白质组学技术包括了质谱分析(mass spectrometry，MS)、高效液相色谱分析(high performance liquid chromatography, HPLC)、液质联用以及蛋白芯片等[7]。与基因组学和转录组学相比，蛋白组学在识别病理条件下细胞内失调的蛋白和通路更高效，有助于发现疾病特异性突变和表观遗传学改变[8]，这也使得蛋白组学成为获取生物学标志物的重要技术手段。2020年权威期刊《NATURE REVIEWS GENETICS》发表综述，认为对人体细胞、组织和体液的“蛋白质组学分析”可为探究人类复杂生物学过程提供有价值的参考，非常有助于理解遗传和非遗传因素如何影响着疾病的结局，从而揭示与疾病相关的生物学途径和生物学标志物，获得疾病新的药物靶点[7]。

2 骨质疏松症领域人体蛋白组学研究

为了深入研究骨密度的分子决定因素，许多学者开展了蛋白组学研究，对骨相关细胞或组织中表达的蛋白质进行分类筛选，以确定与骨质疏松症发病相关的蛋白质，从而获得诊断骨质疏松症或预测骨质疏松骨折的生物学标志物。

2.1 单核细胞蛋白组学

主要是指从外周血中分离出单核细胞进行蛋白组学分析以鉴定骨质疏松症相关的生物学标志物。由于在骨密度峰值期(即绝经前，20～45岁)，女性骨代谢处于骨形成和骨吸收的相对平衡状态，为探索不同个体之间骨密度差异的内在遗传因素提供了一个独特的“窗口期”。因此，2008年Deng等[9]从1 000名中国绝经前女性中筛选出30名具有极高和极低髋部骨密度的受试者，采集分离外周血单核细胞，通过蛋白组学方法获得38个差异表达蛋白。其中，超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)在骨质疏松症患者体内分别显著上调和下调；由于SOD2可催化超氧化物生成过氧化氢(H2O2)，而GPX1可保护H2O2引起的氧化应激损伤，是人体最重要的抗氧化酶之一，作者提出SOD2和GPX1可能共同作用于细胞，调节H2O2水平。之前有研究表明，H2O2可以刺激破骨细胞分化，并增强成熟破骨细胞活性[10]。此外，在RAW 264.7细胞系中过表达GPX可抑制其向破骨细胞分化和形成[11]。因此，Deng等在低骨密度组中检测到的SOD2上调和GPX1下调可能促进破骨细胞的分化、形成和活性，在骨质疏松症发病机制中起重要作用。

Deng等[12-13]针对绝经前白人妇女的研究结果显示膜联蛋白A2(ANXA2)和凝溶胶蛋白(GSN)在低骨密度受试者的外周单核细胞中分别显著上调和下调。体外实验表明，ANXA2可显著促进单核细胞跨内皮屏障的迁移，在低骨密度受试者中ANXA2表达水平升高，可能会刺激更多的单核细胞在体内通过血管壁迁移到骨表面，从而促进单核细胞向破骨细胞分化以及骨吸收，导致骨密度降低[13]。另外，Deng等认为GSN可能通过与雄激素受体(AR)相互作用，增强雄激素诱导的AR反式激活，从而抑制单核细胞的生长，并促进单核细胞凋亡，减少破骨细胞的形成和骨吸收，增加骨密度[12,14]。2015年Daswani等[15]研究发现与RANKL相关的热休克蛋白27(HSP27)在绝经前和绝经后低骨密度妇女的单核细胞中均明显上调；与上述ANXA2研究类似，HSP27体外实验也提示HSP27可促进单核细胞的迁移，从而促进破骨细胞的形成和骨吸收。综上所述，ANXA2、GSN和HSP27有可能作为骨质疏松症的潜在生物学标志物。2017年Zeng等[16]建立了第一个人单核细胞蛋白组学库，共包含2 237个蛋白质编码基因，也将为单核细胞生物学与骨质疏松症的深入研究提供了参考。

2.2 血清、血浆蛋白组学

主要是指用蛋白组学的方法直接从血浆或血清中鉴定相关生物学标志物。Ozgocmen等[17]研究提示患有骨质疏松症的绝经后女性的血浆中SOD酶活性显著高于非骨质疏松症组；此外，一些生活质量评分，如疼痛、精神和社会功能与SOD酶活性也相关。因此，SOD可能是绝经后女性发生骨质疏松症的重要指标。Zhou等[3]研究发现中国老年人血浆中ANXA2蛋白水平与髋部骨密度呈负相关。体外实验表明，ANXA2以浓度依赖方式调节成骨细胞hFOB1.19生长，其在较低浓度时可促进成骨细胞生长，而在较高浓度时促成骨细胞生长作用减弱，这就解释了在低骨密度者中观察到血浆ANXA2水平升高的现象。当然，血浆ANXA2蛋白水平是否能预测骨质疏松症和骨质疏松骨折还有待于进一步研究。

Bhattacharyya等[18]研究发现绝经后妇女血清中的间α胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4)可使破骨细胞活性增加，导致骨密度降低，骨折风险升高。目前，临床研究中预测骨质疏松性骨折的血清生物学标记物主要是通过横断面研究确定，但也有少部分从前瞻性研究中确定。Arasu等[19]发表了一项前瞻性队列研究，结果显示在老年女性中，血清硬化素(sclerostin)水平越高，髋部骨折风险越大。现在，硬化素抗体Evenity(romosozumab)已被FDA批准上市，用于治疗绝经后伴随有高骨折风险的骨质疏松症。

2.3 外泌体蛋白组学

主要是指从骨相关细胞及其微环境各种组分中分离出外泌体以鉴定相关生物学标志物。近年来，外泌体蛋白组学受到越来越多的关注，其中也包括骨相关细胞来源的外泌体[20-21]。2015年Ge等[20]从小鼠来源MC3T3细胞培养上清液中分离出微囊泡，用蛋白质谱的方法鉴定了外泌体含量以及潜在的成骨相关蛋白和通路。结果显示，外泌体主要来源于细胞质膜，主要参与蛋白质定位和细胞内信号转导，且真核细胞起始因子2通路在成骨过程中起着重要的作用。2018年Xie等[22]对老年骨质疏松症或骨量减少患者和正常志愿者血清中纯化的外泌体进行了定量蛋白组学分析，共鉴定了1 371种蛋白。后续生物信息学分析和体外研究表明，骨质疏松症患者血清来源外泌体中蛋白的变化不仅参与了抑制整合素介导的成骨细胞的机械感受和激活，还触发了破骨细胞分化和吸收；相反，骨量减少患者的血清来源的外泌体既促进了破骨细胞激活又促进了新骨形成，这可能导致骨重塑代偿性升高；而老年正常志愿者的血清来源的外泌体可能通过抑制衰老相关的氧化应激而对骨健康起到保护作用。2020年还有类似研究发表，Chen等[23]应用定量蛋白质组学方法比较了骨质疏松症患者、骨量减少患者和骨量正常者血浆外泌体的蛋白表达，共鉴定了45个差异蛋白；其中4个，PSMB9，AARS，PCBP2和VSIR得到了进一步的验证。

PSMB9是一种蛋白酶复合体，一些基础研究已经揭示了蛋白酶体在成骨细胞和破骨细胞活性调节中的重要作用。Garrett等[24]研究发现，抑制蛋白酶体的特定催化β亚基可以通过增强成骨细胞的功能和增加成骨细胞的数量来促进体外和体内的骨形成。Chandra等[25]研究提示一种用于治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂Bortezomib可能在治疗放射性骨质疏松症方面起作用。其余3种蛋白尚未有报道它们与骨质疏松症有关。PCBP2已被证明与RNA结合蛋白K相互作用，后者主要参与破骨细胞形成，调节骨稳态[26]。VSIR是一种免疫调节受体，可抑制BMP4信号，而BMP4参与骨骼和软骨的发育，特别是四肢的发育和骨折的修复[27]。AARS可能导致肌肉无力和萎缩，但没有证据表明AARS对骨量有影响[28]。以上结果为进一步研究骨质疏松的病理机制和治疗靶点提供了参考。

2.4 骨组织蛋白组学

主要是直接从骨骼组织中鉴定相关的生物学标志物。骨组织样本往往参杂了造血干细胞、基质干细胞和内皮细胞等多种细胞类型，由此获得的组学结果反映了一个复合的细胞环境，其中，骨细胞占95 %以上。因此，骨组织蛋白组学结果仍具有较强的说服力[29]。2011年Alves等[30]从4个行髋关节置换术的患者获得健康松质骨片段，然后用质谱的方法进行骨组织蛋白组学分析，产生了一个包含3 038种蛋白的文库。该文库不仅含有大多数经典骨基质蛋白，还包含了一些具有未知功能蛋白，是骨质疏松症等骨相关疾病生物学标志物的来源。2012年Chaput等[31]用质谱的方法，对比患骨关节炎伴有骨量减少和患骨关节炎但骨量正常的患者股骨中蛋白质表达差异。结果表明，在骨量减少情况下，碳酸酐酶I(CA1)和磷酸甘油酸激酶1(PGK1)增加，而载脂蛋白A-1(apoA-1)减少。综上所述，骨组织蛋白组学能反映在骨质疏松症与非骨质疏松症人群骨骼中直接执行功能的差异蛋白，为寻找直接干预的药物靶点提供了全新角度。

3 动物骨质疏松症领域蛋白组学研究

由于伦理原因，利用组学研究人体骨重塑过程还是受到一定限制。此外，人体研究可能会受到许多混杂因素的影响，如饮食和生活方式，这些因素几乎不可能被控制，而且在样本可获得性方面也可能存在限制，动物模型规避了上述问题。当然，动物模型不一定能完全模拟人类疾病生物学过程，比如在骨代谢研究时我们需要考虑动物与人体在骨骼新陈代谢和成分上的差异。

目前，骨质疏松症相关的动物骨组织蛋白组学研究很少。2005年Fan等[32]通过建立去势雌性大鼠(OVX)模型研究雌激素缺乏对大鼠骨骼蛋白表达的影响，结果鉴定出三种不同的蛋白质与骨质疏松相关，分别为硫氧还蛋白过氧化物酶1(TPX1)、肌球蛋白轻肽2(MYL2)和泛素缀合酶E2-17kD(UBE2D2)。同年，Pastorelli等[33]一项针对小鼠的研究表明，与细胞骨架和能量通路相关的蛋白可能是骨组织中重要的雌激素调节蛋白，在骨代谢中起到重要作用。2009年Huang等[34]发现与假手术大鼠相比，OVX大鼠骨组织非胶原蛋白减少。2017年Calciolari等[35-36]首次评估了正常和OVX大鼠在不同阶段骨形成过程中的蛋白质表达，结果发现载脂蛋白E(ApoE)和载脂蛋白A-IV(Apo A-Ⅳ)在OVX大鼠中都显著高表达；此外，凝胶电泳和质谱结果显示骨质疏松大鼠体内炎症和应激反应增强。

4 小结

蛋白质可通过转录剪接、翻译后修饰等机制产生多种产物，对生物生理和病理功能产生直接影响。因此，鉴定在骨质疏松症发生发展过程中起主要作用的蛋白质对明确机制和完善治疗具有重要意义。蛋白组学主要通过检测遗传位点在蛋白质水平的表达变化，来寻找差异表达蛋白质与疾病发生发展之间的关联，以期更准确地推测骨质疏松症的发病机制和治疗靶点。现有证据表明，蛋白组学为骨质疏松症机制研究开拓了全新思路，为寻找可靠的早期诊断、疗效和预后评价的生物学标志物提供了依据。但是，目前通过蛋白组学发现的骨质疏松症相关生物学标志物尚未被转化应用于临床。因此，未来的研究不仅要致力于探索骨质疏松症特异性生物学标志物，还应对已证实的生物学标志物及可能治疗骨质疏松症的药物进行进一步探索效验。从而使蛋白组学技术真正在临床发挥作用。此外，骨质疏松症相关组学研究现在正朝着多组学融合的方向发展，以期更好地理解复杂生理病理机制，其最终目标是根据每一位患者的需要量身定制治疗方案来改善骨质疏松症的结局。