植物黄酮抗骨质疏松作用的研究进展

屈杭帅 郑敬民

浙江省台州医院，浙江 台州 317000

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种全身性骨代谢疾病，以骨量降低、骨组织微观结构破坏为特征，造成骨强度降低、骨脆性增加。国际骨质疏松基金会研究报告指出，中国骨质疏松症发病率约为7 %，其中大于50岁的女性患病率高达50 %，预估 2020年至2050年中国患有骨折疏松症人数约为2.9亿[1]。长期以来，人们认为更年期雌激素缺乏或雌激素和雄激素丢失是导致骨质疏松症的发生的首要原因[2]。但近年研究证据表明，慢性炎性反应、骨免疫异常[3]、氧化应激[4]等发病机制均可通过影响成骨细胞和破骨细胞的来源、增殖、分化、凋亡及其功能，最终导致骨质疏松症。

目前临床用于抗骨质疏松的药物多为抑制骨吸收类制剂，临床疗效明确，但不良反应也愈发引起重视。如双膦酸盐类药物会对胃肠道造成损伤，还会引起下颌骨坏死[5]；雌激素被广泛用于治疗绝经后骨质疏松症，但增加了绝经后妇女中风、血栓栓塞、腿部痉挛和血管运动症状的发生率[6]。鉴于目前合成性骨质疏松抑制剂的不良副作用，开发新的靶向药物具有迫切的现实意义。黄酮类化合物(Flavonoids) 广泛存在于自然界的植物中，是植物中的次生代谢产物，因此也称植物黄酮，主要以结合态或自由态形式广泛存在于蔬菜、水果、豆类和茶叶等食源性植物中。植物黄酮已被证实具有抗骨质疏松活性，且不良反应小、价格低廉、作用机制广泛，是安全理想的天然抗骨质疏松用药。多年来，国内外研究者们已从植物中筛选出大量抗骨质疏松成分，研究较多的有骨碎补总黄酮、淫羊藿总黄酮、大豆异黄酮等，相应活性成分有柚皮苷、淫羊藿苷、大豆苷元等，其中骨碎补黄酮和淫羊藿黄酮已被开发并应用于临床治疗。本文就植物黄酮在细胞分子水平、动物研究、临床应用和网络药理学方面的最新研究结果进行综述，为进一步挖掘植物黄酮中高活性的成分提供研究思路和参考依据。

1 植物黄酮防治骨质疏松症细胞水平及相关信号通路的研究

1.1 植物黄酮对骨髓间充质干细胞及相关信号通路的影响

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是从骨髓中分离得到的具有很强的多向分化能力和增殖活性细胞，正常分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，在骨代谢中发挥着重要作用[7]。但在老年时，BMSCs向成骨细胞的分化程度相对较低，骨形成减少，导致老年骨质疏松[8]。此外，骨髓间充质干细胞的衰老也是老年性骨质疏松症的重要原因[9]，但确切机制尚不清楚。因此，BMSCs的异常分化和衰老导致成骨细胞数量减少、骨形成减少，从而导致老年骨质疏松症[10]。

二氢杨梅素(DMY)是一种黄酮类化合物，Zhang等[11]采用DMY诱导人骨髓间充质干细胞，发现DMY (0.1～50 μm)对细胞增殖无杀伤作用，但能提高碱性磷酸酶活性、成骨细胞特异性基因表达和矿物沉积，还能增强β-catenin的活性表达，降低Dickkopf-1(DKK-1)和硬化剂的表达。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂(Dkk-1和β-catenin特异性siRNA)可降低DMY诱导的骨矿生成。这些结果表明，DMY在体外通过Wnt/β-catenin信号通路促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化。槲皮素是一种植物类黄酮，具有雌激素作用，Pang等[7,12]用槲皮素处理骨髓间充质干细胞。CCK-8、ALP、ARS染色和Western blot结果表明，槲皮素促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化，增强骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、Smad1、Smad4、runt相关的转录因子2(RUNX2)、osterix(OSX)、骨桥蛋白(OPN)信号通路的激活和Smad1磷酸化。Zhang等[13]发现槲皮素还能通过miRNA206/Cx 43途径促进BMSCs的成骨分化。Zhang等[11]发现双氢睾酮类黄酮化合物柚皮苷，通过上调microRNA-20a的表达水平来调控成骨水平，并下调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pPARγ)的表达水平，促进骨髓间充质干细胞增殖，且呈剂量依赖性。此外，柚皮苷显著提高OC、ALP和I型胶原的mRNA表达水平。

1.2 植物黄酮对破骨细胞、成骨细胞及相关信号通路的影响

骨处于不断的重塑状态，这对于维持正常的骨骼结构和功能是非常重要的。因此，失衡会导致骨质疏松等疾病。许多类型的细胞和因子参与了骨重塑的过程。成骨细胞和破骨细胞是参与这些进展的两个主要细胞，破骨细胞负责骨吸收，成骨细胞负责新骨形成[14]。

柳穿鱼黄素是一种主要存在于大蓟科飞机草等植物当中的黄酮类化合物。Zhang等[15]发现，在骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)培养过程中，柳穿鱼黄素抑制核因子kappa B配体(RANKL)在骨髓源巨噬细胞(BMMs)培养中诱导破骨细胞形成，这表明这种天然产物可以通过抑制RANKL信号下行级联作用于破骨细胞前体。此外，在Akt和有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号共刺激作用下，柳穿鱼黄素通过削弱活化T细胞胞浆1 (NFATc-1)和c-Fos的核因子，抑制RANKL介导的破骨细胞形成。这些发现表明，柳穿鱼黄素可能通过阻断破骨细胞的活化而发挥抗吸收作用。Al Mamun等[16]研究了在小鼠原代培养的破骨细胞中，长柄菊类黄酮(TPF) 对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响，并在体外探索了其分子机制。研究发现TPF降低了抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性多核破骨细胞的活性，抑制了TRAP和碱性磷酸酶(ACP)的活性，降低了破骨细胞分化基因的表达，包括组织蛋白酶K、金属蛋白酶-2 (MMP-2)、MMP-9、MMP-13和破骨细胞相关受体(OSCAR)的表达。此外，TPF显著降低c-Fos、活化T细胞胞质1 (NFATc1)核因子、活化蛋白-1 (AP-1)等转录因子的表达水平。这些结果表明TPF抑制了破骨细胞的分化和活性。山奈酚是从许多食用植物和传统药物中提取的多酚黄酮类化合物，Kim等[17]研究发现山奈酚对自噬相关因子p62/SQSTM1的表达有强烈的抑制作用。后续实验发现仅应用3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬时，破骨细胞和凋亡相关因子没有受到显著影响。然而在用山奈酚处理细胞后，这些因子抑制自噬并激活细胞凋亡。因此推测山奈酚通过降解p62/SQSTM1来抑制自噬激活的细胞凋亡。进一步研究p62/SQSTM1基因作为自噬机制的靶点，可能有助于阐明山奈酚在骨代谢紊乱治疗中的潜在作用。Adhikary等[18]研究发现山奈酚通过BMP 2和ERK途径抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡，促进成骨细胞的分化和增殖。Kim等[19]验证高良姜素、淫羊藿苷、山奈酚和槲皮素等黄酮类化合物在低剂量时可以增加人SV40转染成骨细胞(hFOB 1．19)的增殖。高良姜素、淫羊藿苷、山奈酚、槲皮素可减少唑来膦酸钠诱导的细胞损伤，尤其高良姜和山奈酚对唑来膦酸具有显著的细胞保护作用。

2 植物黄酮防治骨质疏松症动物水平的研究

骨质疏松症主要类型是绝经后骨质疏松症、废用性骨质疏松症和糖皮质激素诱发的骨质疏松症[20]。为了避免实验研究对人体的各种伤害，同时能在较短的时间内成功地模拟疾病的病理状态，科学家们构建骨质疏松动物模型，为人类认识骨质疏松的病理和药物的作用效果提供一种手段。目前研究中常用的骨质疏松动物模型，一般分为4大类：激素干预型、废用型、营养型，其他类型等骨质疏松模型，实际上应用最广泛的是激素干预型中通过去卵巢诱发的骨质疏松动物模型[21]。

Xu等[22]探讨淫羊藿苷联合脂肪源性干细胞对绝经后卵巢切除后骨质疏松大鼠模型的治疗作用。采用ELISA法测定血清中碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、骨保护素和骨钙-羧谷氨酸蛋白水平。采用双能X线骨密度仪测定骨密度。实验结果显示淫羊藿苷联合干细胞显著降低血清中碱性磷酸酶、酒石酸抗性酸性磷酸酶和骨钙素-羧谷氨酸蛋白水平，显著提高骨保护素水平，显著提高腰椎骨密度，增强了股骨的生物力学特性，包括最大弯曲载荷、弯曲刚度和骨折能量。结果提示淫羊藿苷与干细胞联合改善大鼠骨质疏松所致的骨量减少和骨组织微结构的破坏。Oršoli等[23]通过分析实验动物的股骨骨密度、骨钙磷总水平、股骨几何和物理特征以及肝、肾细胞脂质过氧化和谷胱甘肽水平评估植物黄酮对健康大鼠骨骼系统的影响，结果发现槲皮素、白杨素、柚皮素3种植物黄酮均能改善维甲酸诱导的骨重系数、骨长、骨径、骨灰分含量和钙磷含量的降低，降低维甲酸诱导的氧化应激和骨质流失。Kai等[24]采用悬尾法建立骨质疏松模型，骨密度测定结果表明，葛根素能显著提高后肢悬吊引起的胫骨和椎骨的骨密度。力学参数实验表明，葛根素能有效提高胫骨和椎骨的最大载荷和弹性模量。酸性复红染色结果显示，葛根素组骨小梁数量增加，骨小梁厚度变厚，骨分离变小，后悬术后骨微结构得到明显改善。血清生化指标显示葛根素可促进骨形成指数骨钙。

3 植物黄酮防治骨质疏松症临床个体水平的研究

近年来研究发现，植物黄酮在临床防治OP效果显著，研究较多的是骨碎补黄酮和淫羊藿黄酮。强骨胶囊作为治疗原发性骨质疏松症的代表性中成药，其有效基础物质是骨碎补总黄酮。杨锋等[25]将合并牙列缺损或缺失的骨质疏松患者随机分为实验组(强骨胶囊治疗组)和对照组(阿仑膦酸钠片治疗组)两组，每组各23例。实验结果发现在药物治疗后第3、6个月后，实验组牙槽骨的颊(唇)侧皮质骨密度较对照组显著增高，表明骨碎补黄酮能增加OP患者牙槽骨骨密度水平，且疗效高于阿仑膦酸钠片。张金虎[26]将110例KOA患者随机分成对照组和治疗组，每组55例，治疗组给予骨碎补总黄酮联合硫酸氨基葡萄糖治疗，对照组单纯给予硫酸氨基葡萄糖治疗。经过3个月的药物治疗，通过比较患者的Lequesne评分、VAS评分较、CTX-1、TRACP-5b、TNF-α和TGF-β1，发现治疗组治疗有效率显著高于对照组。表明骨碎补总黄酮联合硫酸氨基葡萄糖治疗膝骨关节炎具有较好的临床效果。吴浩然等[27]以黄芪桂枝五物汤合补骨脂、骨碎补、杜仲三味小方治疗糖尿病周围神经病变合并骨质疏松症，临床效果满意。楼兴法[28]研究发现老年骨质疏松性桡骨远端骨折患者辅以淫羊藿总黄酮治疗后，骨折愈合时间有效缩短，腕关节功能恢复较快，骨质疏松得到改善。RCE是一种富含异黄酮苷元和益生菌的新型红三叶草提取物，Lambert等[29]发现RCE摄入与补充(钙、镁和骨化三醇)相结合比单独补充更有效，更加有效地减轻雌激素缺乏引起的骨密度损失，改善骨周转率，促进有利的雌激素代谢产物，并刺激绝经后骨质减少的妇女产生马酚。

4 植物黄酮防治骨质疏松症网络药理学方面的研究

中药复方由多种天然产物配伍而成，存在成分复杂、靶点和机制不清，因此研究难度大。网络药理学的目的是通过网络分析和网络验证，实现生物活性化合物与目标之间的相互作用和目标之间的相互作用，从而发现和验证关键节点。网络药理学研究主要包括目标发现、生物活性化合物筛选、毒性评价、机理研究和质量控制研究[30]。将网络药理学应用在中药复方研究，能帮助解决传统中药复方机制研究的难题，使先前难以定性的机制得以预测和验证。

淫羊藿叶是治疗骨质疏松症最常见的中草药之一，柯志鹏等[31]通过成分-靶网络分析表明，黄酮类化合物具有雌激素样活性、抗氧化和清除自由基的活性，在防治骨质疏松方面具有一定的作用。另一方面，高度靶点主要与性激素、破骨细胞分化、骨基质降解、药物靶网活性氧等有关。Xu等[32]通过有效成分筛选、药物相似性评价、中药特征映射、靶标预测、验证和网络分析，建立了淫羊藿类药物与雌激素抗骨质疏松症关系的系统药理学模型。分析结果表明，淫羊藿类药物通过直接调节雌激素相关的11个靶点和一组靶蛋白在5个雌激素相关通路上发挥抗骨质疏松作用。马江涛等[33]基于网络药理学，通过TCMSP等平台筛选得到骨碎补治疗骨质疏松性骨折的14个有效成分和51个中药-疾病靶标，探讨了骨碎补治疗骨质疏松性骨折的作用机制。仙灵骨葆胶囊具有滋强筋壮骨功效，主治瘀血阻络所致骨质疏松症。綦向军等[34]基于网络药理学获取仙灵骨葆115种活性成分，活性成分所涉及的靶标共有301个。黄酮类化合物(槲皮素、山奈酚)作为其中核心活性成分，主要通过调节OPG/RANK/RANKL，抑制破骨细胞，促进成骨细胞分化；淫羊藿苷元可增强成骨细胞活性。肉苁蓉(Cistache tubulosa，CT)是一种应用广泛的中药，分别被广泛应用于骨质疏松症(OP)和阿尔兹海默症(AD)的治疗[35]。Li等[35]通过整合多个数据库和网络药理学层面的广泛分析，筛选出CT中22种与81例OP和AD 相关靶点密切相关的双效活性成分，进一步分析发现其中的黄酮类化合物具有较好的生物活性。

5 展望

细胞、动物实验和临床实践表明，植物黄酮对骨质疏松症有显著的治疗作用。植物黄酮的有效成分具有多种多样的化学结构，包括骨碎补总黄酮、淫羊藿总黄酮、大豆异黄酮等。植物黄酮抗骨质疏松作用机制涉及多种调控途径，如Wnt/β-catenin、BMP/Smad、MAPK通路和RANKL/OPG系统。因此利用网络药理学加深对植物黄酮防治骨质疏松的药理学研究，筛选植物黄酮中有效核心成分并开发新型抗骨质疏松药物，在抗骨质疏松临床治疗中具有广阔的应用前景。