Wnt/β-catenin信号通路调控成骨细胞、破骨细胞在骨质疏松中的作用探讨

张帆 梁清洋 韩超 刘佳* 唐毓金*

1.右江民族医学院附属医院骨外科，广西 百色 533000 2.右江民族医学院临床医学院，广西 百色 533000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种与衰老相关的骨骼疾病，包括骨质和骨骼结构的恶化，从而增加骨折的风险。OP是我国最常见的慢性疾病之一，在老年人的骨疾病中居于首位。社会老龄化的日益加重，使我国OP患者数量突破了1亿，预计30年后，患者数量极有可能增长一倍。流行病学调研[1]显示，年龄超过50岁的人群OP患病率为19.2 %，其中男性为6.0 %，女性为32.1 %，城市地区为16.2 %，农村地区为20.7 %，年龄超过60岁的人群患病率更是超过30 %。可以得出，随着未来我国老年人口数的不断增加，骨质疏松症将持续成为一场公共卫生和医疗保健领域的严峻挑战。

成骨细胞(osteoblasts，OB)起源于骨髓间充质干细胞(BMSC)，是存在于骨组织中，起到接受刺激和发挥效应作用的细胞，它最终可以分化为成熟的骨细胞。各种因素的刺激都可以造成细胞分化的增殖或凋亡，产生许多骨骼相关的疾病[2]。破骨细胞(osteoclasts，OC)，由Kolliker于1873年首次发现，来源于单核-巨噬细胞系，主要负责调控机体的骨吸收。破骨细胞还通过分泌可溶性因子(包括S1P、CTHRC1和C3)影响成骨细胞的形成和分化。成骨细胞/破骨细胞轴功能异常在OP的发展中起关键作用，只有成骨和破骨达到一种稳态，才能使机体骨量维持正常，否则，就容易发生OP、骨硬化症等骨病。

1 Wnt信号通路的组成及细胞内调控机制

自1982年努斯(R Nusse)和瓦尔莫斯(HE Varmus)首次发表涉及Wnt家族的第一篇文章以来，对Wnt信号的探索逐渐深入，涉及细胞的分化、维持、免疫、应激、癌变和凋亡，机体的生长、发育、疾病、衰老与死亡等多个方面。Wnt是一大类糖蛋白的统称，它们多位于细胞外，以结构中存在大量的半胱氨酸为特征。

Wnt信号转导包括经典的β-catenin途径、平面细胞极性途径和Wnt/Ca2+途径等。本文重点关注依赖β-catenin的经典通路。研究[3]发现组成经典Wnt信号通路的传导分子包括Wnt分泌蛋白、跨膜受体卷曲蛋白、松散蛋白、β-连环蛋白、糖原合成激酶3β、轴蛋白、T细胞因子/淋巴增强因子、酪蛋白激酶1、低密度脂蛋白受体依赖性蛋白5/6等。β-连环蛋白是重要的功能蛋白之一，早期发现其具有粘附分子的作用，维持细胞膜的稳定，还涉及重要的细胞活动-信号转导，它是介导成骨细胞生长和分化的关键因子。其中β-catenin的细胞核内含量的变化是信号转导的关键步骤。

Wnt配体是一类分泌型糖蛋白[4]，含有19个胞外配体的大家族，可以同时激活Wnt经典和非经典途径，从而诱导复杂信号网络的形成。首先，Wnt蛋白先粘附到细胞表面，与Frz和LRP5 /6受体复合物相结合，再继续活化细胞膜内的Dsh蛋白，Dsh蛋白活化后可抑制GSK3β，使β-catenin可以和钙粘附蛋白E组成复合体，然后β-catenin不断地积聚，向细胞核定向移动，主动的结合转录因子TCF/LEF，形成基因转录的复合体，最后在相关辅助因子的作用下启动转录过程，调控靶基因的表达，产生生物学效应。这样，信号就由Wnt蛋白这一个位点开始转导到整个通路上，然后对整个机体产生网状的效应。

2 对成骨细胞的调控作用

成骨细胞的功能主要是分泌胶原纤维和蛋白多糖，在骨形成阶段发挥作用。在骨骼受到损伤时，机体首先反应是成骨细胞增殖、成熟，形成新生的骨组织，这个过程受到各种因素的调控，如果成骨受到影响就可能导致骨质疏松。

研究发现在体内Wnt3a可以激活β-catenin，在体外Wnt3a等蛋白可以抑制成骨细胞的凋亡。彭杨茜子等[5]发现Wnt3a可以促进小鼠成肌细胞(C2C12)的增殖、提高ALP的活性和加强骨保护素的表达，最终促进成骨。基因研究[6]发现KLF14在BMSC中高表达，抑制KLF14表达可促进BMSC的成骨分化，Wnt3a启动子与KLF14相互作用，导致Wnt3a和Wnt信号通路中下游成骨相关靶基因的表达下降。也有研究[7]认为Wnt3a与骨形态发生蛋白9具有协同作用，共同加强碱性磷酸酶在间充质干细胞中的表达。Wnt3a也可以调控雌激素受体的表达，雌激素正向调节BMSC向成骨方向分化。

Bennett等[8]培育人骨钙素启动子过表达的转基因小鼠，发现股骨骨密度、骨体积分数和骨小梁数较野生型小鼠显著增高，而成骨细胞凋亡或破骨细胞数量和活性无明显变化，得出Wnt10b主要通过刺激成骨细胞的生成来增加骨量。Wnt16被认为是皮质骨的重要调节蛋白，可以增加体内皮质骨骨小梁的质量和强度。魏双双等[9]研究发现将Wistar雌性大鼠切除双侧卵巢后，雌激素分泌减少，导致骨质疏松，补充外源性雌激素4个月后，检测Wntl6mRNA表达升高，说明雌激素也可能通过Wnt16进一步调节成骨。Wnt5a是Wnt家族的非典型成员，既往研究仅涉及非经典Wnt途径。实验中，构建Wnt5a-/-基因小鼠，发育成熟后小鼠表现出低骨密度，骨矿化减少[10]。Wnt5a还可以抑制β-catenin信号，降低特异性周期蛋白-D1的水平进而抑制Wnt3a。新的一项研究[11]表明它也可以影响ROCK的活性来促进ALP活性升高，提高RUNX2和骨钙素基因的表达，下调成脂标志物等，可能影响经典Wnt通路。同时，Wnt信号在成骨超过正常时，自身的促进成骨作用减弱以维持机体的骨平衡[12]。

3 对破骨细胞的调控作用

破骨细胞是一种非传统意义的多核巨噬细胞，通过单核前体细胞融合形成，与骨吸收、骨重建密切相关。破骨细胞分化成熟的过程受到多种细胞因子的调控，Wnt信号转导通路激活后，可以调控破骨细胞的表达。细胞研究[13]表明β-catenin和TCF蛋白一样，都可以调节存在于成骨细胞中具有抑制破骨细胞分化作用的骨保护素的表达。构建转基因小鼠模型，将β-catenin基因敲除后，发现破骨细胞表达增加，小鼠表现重度骨质疏松，提示Wnt信号可能是负向调控破骨细胞的分化来维持骨稳态。

Wnt3a间接调控破骨细胞。研究[14]证实Wnt3a可以通过成骨细胞调控RANKL的表达，来抑制破骨细胞生成。RANKL/OPG/RANK信号途径是破骨细胞形成和活化的主要调控系统。RANKL是破骨细胞分化和骨吸收的关键介质[15]。成骨细胞谱系细胞(包括成骨细胞和骨细胞)表达RANKL，RANKL受多种不同因素的调节，包括激素，细胞因子和机械力等。RANK的化学本质是一种跨膜蛋白，在单核/巨噬细胞内发现。OPG是一种肿瘤坏死因子受体(TNFR)，一种糖蛋白，存在形式有分子质量为60 ku的单体和分子质量为120 ku的同源二聚体。OPG的作用是直接抑制RANK/RANKL复合体的活性，也可通过与RANK竞争性结合RANKL，间接抑制骨吸收。Kondo等[16]发现，糖皮质激素通过下调OPG的表达，抑制Wnt信号通路从而造成骨量下降。人工敲除小鼠OPG基因，小鼠会发生骨质疏松症，如果该基因过度表达，将可能导致石骨症。目前人工重组OPG、RANKL单克隆抗体已应用于临床[17]。

Wnt5a可以激活经典Wnt信号通路，也可以直接作用于破骨细胞[18]，成骨细胞及滑膜细胞分泌的Wnt5a与破骨细胞前体细胞中Ror2结合，共同激活JNK，进而c-Jun被招募到RANK启动子Sp1，促进RANK的表达，从而增强破骨细胞生成。Wnt16通过非经典途径抑制T细胞核因子(nuclear factor of activated Tcells 1，NFAT1)激活，实验中如果将已被特异性敲除Wnt16(Wnt16-/-)的成骨细胞在1α,25-二羟维生素D3诱导条件下与破骨细胞共同培养，可以发现破骨细胞的分化增强，这进一步证实Wnt16负向调控破骨细胞的形成[19]。另外，Wnt16也可以激活MC3T3-E1细胞(小鼠前成骨细胞)中的Wnt/β-catenin信号，诱导OPG的表达，进而抑制RANK-RANKL相互作用间接抑制破骨细胞分化。由此，推断Wnt蛋白在破骨细胞不同阶段可能都具有调控功能。

4 Wnt信号异常对OP发生发展的作用

人体骨骼系统持续不断的进行着骨吸收与骨重建，这个动态循环中，破骨细胞分化成熟后进行骨吸收，成骨细胞负责形成新生的骨质。成骨细胞和破骨细胞通过直接的细胞间接触或分泌蛋白相互沟通，以调节细胞行为、存活和分化。成骨细胞发生退变或破骨细胞过度活跃都会导致骨的微细结构和生物力学的改变，从而导致OP[20]。Wnt/β-catenin信号的两个抑制剂Dickkopf-1(DKK-1)和SOST在骨稳态中起着关键作用，其不仅是药物调节的潜在靶标，还是可溶性的生物标志物。

DKK的研究主要涉及骨代谢和肿瘤等领域。研究最成熟是DKK-1[21]，它是含有2个富含半胱氨酸结构域的一种分泌性糖蛋白，通过与Wnt竞争性结合LRP5/6受体，来阻断Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制骨形成。一项国外大数据临床研究发现OP患者血清DKK-l显著高于正常组。Li等[22]发现用表达BMP9的腺病毒转染大鼠卵泡干细胞后，给予高浓度的DKK-1可以减少BMP9转导的大鼠卵泡干细胞的成骨分化，而低浓度的DKK-1则促进了BMP9诱导的骨形成，这是通过经典和非经典Wnt信号通路共同作用的。基因研究[23]表明，小鼠DKK-1基因的表达水平与其本身的的骨量呈负相关，DKK-1水平越高，越使骨组织的微细结构被破坏，骨强度减低，骨量减少，提示我们DKK-1检测可以用于评估骨质疏松的严重程度。新的研究[24]揭示骨质疏松也与铁的过载有关，通过小鼠动物模型研究发现，在正常情况下经典Wnt信号通路中的β-catenin与下游TCF/LEF家族中TCF4/TCF7L2分子结合促进骨形成。在铁蓄积情况下β-catenin与下游TCF4/TCF7L2分子结合减少，与FOXO3a结合增多，因此会抑制经典Wnt信号通路，抑制骨形成进而导致骨质疏松。所以，在临床上可以使用铁螯合剂，例如去铁胺、乳铁蛋白等改善骨质疏松。

硬化蛋白(Sclerostin)是骨骼中的天然激素，一种由骨细胞合成的抗合成蛋白。在骨骼中起分解代谢作用，并通过增加破骨细胞的骨吸收参与骨代谢的调节。硬化蛋白水平随年龄增长而增加，其可用性增加的结果可能是Wnt信号级联的破坏。研究[25]发现，SOST基因小鼠的皮质骨中硬化蛋白的表达比小梁骨中的表达更明显。用抗RANKL抗体治疗C57BL/6小鼠后，小梁骨中硬化蛋白阳性细胞数量增加，而小梁骨中β-catenin阳性细胞数量和骨形成减少，说明骨小梁中硬化蛋白的表达受抑制可以促进骨转换。Miyatake等[26]发现，IL-1β在OA晚期诱导软骨形成分化，并促进终末钙化。硬化蛋白在晚期可以恢复IL-1β诱导的β-catenin信号的上调，在维持关节稳态中起关键作用。Ohsugi等[27]发现，激光的生物刺激作用抑制了原代成骨细胞中SOST的表达。激光通过抑制硬化蛋白表达而不引起炎症，可能成为骨质疏松症的一种新治疗方法。罗莫珠单抗(Romosozumab)是一种人源化单克隆抗体，可特异性地结合骨硬化蛋白，拮抗其对骨代谢的负向调节作用，保证Wnt/β-catenin信号通路的正常传导。

5 小结与展望

骨质疏松症的药物按原理不同可分为骨吸收抑制剂、骨形成促进剂等[28]。双膦酸盐类是传统的一线用药，较常见的是阿仑膦酸钠，用药后破骨细胞活性受到抑制，骨形成增加，机体骨量升高，但也有研究表明其有导致骨折不愈合的风险。甲状旁腺素(PTH)[29]是目前较新的骨形成促进剂，PTH给药后可提高血清钙水平。实验发现，PTH可通过β-catenin信号阻断糖基化终末产物(AGEs)对大鼠BMSC的负性成骨作用，显著增加骨量[30]。临床研究发现，与安慰剂和替代性骨质疏松疗法相比，使用Romosozumab后，骨矿物质增加，新发椎体骨折显著减少[31]。Romosozumab使用后短期就有促进骨形成的作用，长期应用还可以减少骨吸收，可能为临床上治疗骨质疏松提供新的方向。另外，Denosumab一种新的RANKL中和抗体的出现，表明应用Wnt通路靶点的抑制剂和中和抗体在治疗OP方面具有崭新的前景[32]。动物研究[33]中，构建骨质疏松性骨折大鼠模型后，发现BMSC组大鼠骨密度恢复快、力学负荷明显改善和骨折线愈合良好，表明骨髓间充质干细胞的移植也可能治疗骨质疏松。Li等[34]对比糖尿病骨质疏松症和对照组C57BL/6小鼠高级糖基化终产物的变化，发现AGEs可以通过激活DNA甲基化并抑制β-catenin途径来抑制脂肪干细胞的成骨分化能力，证实DNA甲基化可以增强骨修复和促进骨再生。

综上所述，Wnt/β-catenin信号通路可以调节与骨相关的生物信息信号传递，还有更多的预防和治疗骨质疏松的潜在药物靶标尚未被发现。