从骨免疫学到骨微生物学：肠道微生物如何调节骨骼

王钢 田杰祥 周孟茹 李平顺*

1.甘肃中医药大学附属医院风湿骨病科，甘肃 兰州 73000 2.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州 73000

人体肠道中大约有100万亿个微生物，包括细菌、古细菌、真菌和病毒。在已鉴定的多种微生物中厚壁细菌、拟杆菌、微藻、放线菌和变形杆菌占大多数[1]。这些微生物比人类自身具有更多的遗传表型，但是它们在维持身体健康方面的作用却被大大忽略了。肠道微生物群(gut microbiota，GM)通过帮助食物消化吸收，分泌代谢产物和保护黏膜屏障功能，在维持人体生理平衡中起主要作用。但是，微生物的失衡会释放出对器官起作用的蛋白质、肽和代谢产物，从而导致全身性多器官功能障碍[2]。骨骼作为人体的负重器官，具有活跃的新陈代谢，在日常活动中具有重要意义。骨质疏松症(osteoporosis，OP)的特征是由于骨量和(或)质量的降低而增强了骨骼的脆性，其风险既取决于在20至30岁时达到的峰值骨量，也取决于随后的年龄依赖性骨量流失的速度。研究表明，峰值骨量变异的50%至85%是由遗传决定的，但是对于与年龄相关的骨质流失，环境因素似乎起着更为明显的作用[3]；GM与宿主之间的共生需要微妙的平衡，一旦破坏，可能会增加OP的风险。最近的研究表明，GM是骨量的调节剂，主要通过对炎症和免疫作用介导的，而免疫系统又调节破骨细胞的生成。因此，免疫系统和微生物群均对骨稳态起着至关重要的作用，这一认识意味着从“骨免疫学”领域向“骨微生物学”[4]的进化。对于这一术语的定论为延迟OP提供了新的理论基础，并为临床难治性OP提供了新的治疗方向。

1 骨免疫学

1.1 炎症-免疫系统-骨量流失环节

骨免疫学是描述免疫系统和骨骼系统之间相互作用的领域。炎症和骨量流失之间的联系已得到很好的确立，在OP等骨代谢疾病中，破骨细胞(osteoclasts，OC)的骨吸收与活化的T细胞及其产生的OC原性细胞因子密切相关[5]。CD4+T辅助(Th)细胞亚型的失衡可能是OP患者OC增多的第一个驱动因素：①Th1分化产生几种与骨代谢控制有关的细胞因子(例如IFNγ、TNFα、RANKL、TNFα和RANKL是众所周知的促OC生成细胞因子)；②Th17在炎症和OP的发展中起着至关重要的作用，Th17细胞产生IL-17通过增加RANKL的释放而参与OC上调，而RANKL的释放可能与IL-1和TNF-α协同作用导致骨量流失；③已知T调节细胞(Tregs)对于维持外周耐受机制和预防自身免疫至关重要，然而炎症环境可抑制Tregs的功能活性，Treg相关细胞因子(IL-10、IL-2和TGF-β)将相应减少，致使抑制自身免疫反应作用降低，进一步加剧OP。

T细胞不仅通过细胞因子促进OC活性，而且通过细胞间的相互作用与OC相互影响。OC的行为类似于APC，且它们与树突状细胞和巨噬细胞具有相同的前体。OC表达的主要组织相容性复杂分子和共刺激分子参与调节T细胞对免疫刺激的应答，例如CD80和CD86；CD80和CD86在专业APC和OC上均有表达，并与活化T细胞上表达的CD28结合[6]。研究表明，T细胞表面表达CTLA-4信号分子，可通过中断CD80/86和CD28复合物形成以严格调控T细胞活化，因此这些分子在OC-T细胞相互作用中起着至关重要的作用。例如，CD80/86信号分子缺陷型小鼠表现出OC分化活跃，主要因CD80/86缺陷型OC不受CTLA-4或Tregs抑制；在人体实验中，使用CD80/86靶向药物可减少OC形成，而使用阻断CTLA-4的靶向药物可上调OC形成[7]。因此，T细胞和OC之间的相互作用可能是OP中OC增多的基本机制。

1.2 性激素流失-免疫系统-骨量流失环节

绝经后骨质疏松症是最常见的代谢性骨骼疾病。其特点是骨矿物质密度降低和骨骼的微结构退化，骨折风险增加。在绝经后OP中，OB介导的骨形成与OC介导的骨吸收之间的解偶联导致骨量流失。雌激素缺乏是绝经后骨量流失的主要驱动力：在雌激素消耗期间，OC的形成和活性增加，这种增加部分是通过雌激素缺乏对免疫系统的影响来介导的。

有关动物和人类的数据表明，雌激素可增强细胞和体液免疫反应。在雌激素缺乏期间，免疫反应发生改变，特别是T细胞变得更加活跃，并能够产生炎性和促OC生成的细胞因子[8]。雌激素缺乏诱导骨髓T细胞增殖并延长寿命的关键机制之一是巨噬细胞和树突状细胞的抗原呈递增加，这归因于II类反式激活因子(CIITA)(一种转录蛋白)的高表达[9]，CIITA可与巨噬细胞和树突状细胞的组织相容性复合物II类启动子结合以发挥数量与功能上调的最终作用。另外，CD40/CD40 L系统对于T细胞活化和免疫系统的多种功能至关重要：CD40/CD40 L可促进巨噬细胞的活化和分化、抗体同种型转换以及B细胞中免疫记忆维持[10]。雌激素缺乏导致T细胞CD40配体(CD40 L)表达的上调促进了基质细胞表达M-CSF、TNFα和RANKL，并下调了OPG表达，导致OC生成显着增加[11]。

2 骨微生物学

骨微生物学是指微生物群在骨骼健康中的作用，以及微生物群调节骨骼发育、骨骼老化和病理性骨量丢失的机制；该研究领域旨在弥合骨骼生理学、胃肠病学、免疫学和微生物学之间的差距[12]。研究表明，GM是骨代谢的关键调节剂，GM菌群失衡可能通过调节免疫系统参与了OP的骨量丢失；例如，在无菌条件下饲养的小鼠(即具有无菌肠道的小鼠，称为“无细菌”小鼠)的骨小梁骨量与在常规条件下饲养的小鼠相比骨骼质量和密度增加，而骨形成没有改变；同时，“无细菌”小鼠由于肠道黏膜免疫系统不成熟，表现出免疫系统的改变，脾脏中的T辅助细胞数量明显减少，这也说明GM负责正确地发展全身免疫力[13]。这些观察结果反向表明，免疫系统异常可能是GM失调继发OP发病机制中最关键的环节，此外，GM还可能通过影响宿主的新陈代谢和内分泌环境影响骨稳态。因此，本文将从免疫系统、新陈代谢和内分泌环境以及其他因素回顾GM对骨代谢的影响。

3 微生物群影响骨骼健康机制

3.1 新陈代谢

3.1.1脂多糖(LPS)：LPS主要存在于革兰氏阴性菌中，通过激活转化生长因子(TGF)和Toll样受体来刺激炎症，上调OC活性。GM通过维持肠道细胞健康紧密连接并维持黏液保护层来调节细胞的通透性，肠道菌群失调会增加肠道细胞的通透性，导致更多的LPS进入循环系统，导致代谢功能障碍(肠道菌群失调会增加肠道pH值并降低钙吸收)和炎症(LPS可以上调骨干S端区域的炎性介质，如IL-1、COX-2、TNF)[14]。Chongwatpol等[15]和Amar等[16]对大鼠实施LPS药丸干预以模拟慢性炎症的体内模型，发现LPS显着降低了骨小梁体积与骨矿物质密度。

3.1.2胆汁酸：胆汁酸经历“肠肝循环”，并在厌氧细菌的影响下转化为次级胆汁酸；GM通过法尼醇X受体(Farnesoid X receptor，FXP)和膜结合G蛋白偶联受体(G protein-coupled bile acid receptor，TGR5)信号传导可改变次级胆汁酸的量和类型，从而产生不同的代谢作用[17]。某些类型的适量次级胆汁酸是TGR5的激动剂，刺激TGR5可以增加胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的产生，GLP-1是一种肠内激素，可以激活甲状腺C细胞增殖并促进降钙素分泌，从而抑制骨吸收；GLP-1还可以刺激OB增殖并抑制OC[18]。另外，过量单羟基化的石胆酸(lithocholic acid，LCA)可作为一种维生素D受体(VDR)配体影响维生素D刺激OPG和RANKL的基因表达，间接控制骨骼的基因翻译；同时，LCA可能损害OB线粒体并降低OB活性[19]。因此，过量的LCA可能在OP的发病机理中起作用。

3.1.3短链脂肪酸(SCFA)：结肠中的细菌可以将难消化的碳水化合物发酵成SCFA，包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。另外，氨基酸的肠细菌发酵也会产生SCFA。SCFA具有通过膜蛋白(SLC5A8、GPR41、GPR43、GPR109A)影响Tregs的发育能力，可以促进抗炎环境，抑制骨量流失。具体机制如下[20]：①GPR109A被丁酸酯激活，通过诱导IL-18分泌抑制炎症；②被乙酸盐激活的GPR43通过诱导炎症细胞凋亡促进炎症的消退；③被丁酸酯激活的GPR41通过抑制NF-κB的激活来抑制OC数量与活性；④SLC5A8通过抑制组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制炎症。

3.2 免疫系统

免疫系统是宿主防御系统，在正常情况下，GM和免疫系统可维持人体健康；但是，由于各种因素引起的肠道菌群失衡也会通过免疫系统促进疾病的发展。在无菌小鼠中，复杂微生物的移植可以减轻骨髓祖细胞的消耗和单核细胞增殖的障碍[21]；这一发现表明GM与免疫细胞的发育有关，免疫系统与OP的发展密不可分。

3.2.1辅助性T细胞和B细胞：肠道微生物失衡会抑制Th1、Th2、Tregs细胞分化，诱导Th17细胞分化，从而诱导OC的分化和增殖，加剧骨量流失。Th17细胞对于激活先天免疫机制(包括诱导上皮细胞产生抗菌肽和募集中性粒细胞)非常重要，同时Th17 细胞被认为是OP发病机制中的主要效应细胞。将分段丝状细菌(SFB)移植到无菌小鼠中可增加Th17细胞的数量，并轻度增加Th1细胞的数量；SFB似乎穿透了回肠末端的黏液层，与上皮细胞接触，并诱导肌动蛋白聚集，诱发Th17极化信号[22]；SFB引发Th17极化信号通路的可能机制：①SFB影响了参与Th17细胞极化的抗菌蛋白RegIIIg的表达；②SFB通过肠上皮细胞产生可能影响DC细胞因子的血清淀粉样蛋白A诱导Th17细胞分化；③Th17细胞的分化取决于肠道树突状细胞对SFB抗原的MHCII依赖性抗原呈递。Treg细胞的分化是由短链脂肪酸诱导的，在小鼠中，厚壁细菌，尤其是梭状芽胞杆菌可促进Tregs在结肠固有层中的积累，抑制炎性环境从而下调OC分化与形成，对骨质具有保护作用。

B淋巴细胞通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物的雷帕霉素靶标(mTOR)信号转导途径控制RANKL/OPG比率，从而调节骨细胞的生长速度；肠道菌群会影响mTOR转录因子的表达，若敲除TSC1表达(mTOR的负调节剂)会导致RANKL/OPG比值增加，从而加速OC增殖[23]；同时，肠道菌群也会影响B细胞发育和B细胞的OPG产生，OPG除了可直接抑制RANKL促进OB活性，还可通过调节自噬相关基因和AMP激活的蛋白激酶/mTOR/p70S6K信号传导来抑制OC的分化和骨吸收[24]。

3.2.2NOD1和NOD2信号：NOD1在许多类型的细胞中均有表达，通过识别高表达于革兰氏阴性菌的肽聚糖来诱导促炎信号；NOD2在非造血细胞、骨髓衍生细胞和淋巴细胞中广泛表达，NOD2可以与革兰氏阳性、阴性菌的所有肽聚糖结合，通过NLR与细菌肽结合并吸引受体相互作用蛋白(receptor interaction protein，RIP2)，刺激NF-κB信号通路，上调炎性因子诱导OC生成[25]。在微生物群引起的牙周炎模型中验证了NOD2对骨吸收的作用，而在缺乏NOD2的小鼠中，骨吸收和OC数量显着减少，这表明GM诱导的骨吸收依赖于NOD2信号[26]。

3.2.3Wnt信号：Wnt/β-catenin信号通路在OP发病中的核心作用得到公认，其对OB分化、生长、凋亡及功能表达具有重要意义。Wnt/β-catenin信号通路可以被某些细菌抑制，例如核梭形杆菌和脆弱拟杆菌可以使结肠巨噬细胞极化为M1状态，从而产生内源性炎症细胞因子(以TNF为主)，这些事件称为微生物诱导的旁观者效应(microbial-induced bystander effects，MIBE)[27]。研究表明，TNF通过抑制Wnt3和诱导Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor 1，WIF1)以抑制Wnt/β-catenin信号通路[28]，从而导致骨量减少骨质流失。

3.3 内分泌环境

3.3.1性激素：据报道，某些GM可能具有代谢性激素并影响其活性的能力。例如，肠道共生梭菌梭状芽胞杆菌通过羟类固醇水解酶和其他酶将糖皮质激素转化为雄激素[29]；而编码β-葡糖醛酸糖苷酶的微生物参与雌激素的肠肝循环[1]。许多研究已经证实雌激素、雄激素在骨代谢中的作用，但其作用机制非常复杂，需要更多的人类研究来证实肠道微生物群是否可以通过调节性激素系统的转化直接影响骨骼代谢。

3.3.2胰岛素样生长因子1和胰高血糖素样肽1：胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是上调软骨细胞和OB分化与活性的关键因子，其机制主要通过Akt-mTOR途径调节并诱导eNOS水平持续升高，从而促进OB分化与炎性因子表达[30]。肠L细胞分泌的胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)可促进OB分化并抑制间充质干细胞且促进其并转化为脂肪；GLP-2具有很强的肠道亲和力，并可以通过转化生长因子β-SMAD2/3-iNOS-NO-半胱天冬酶3-B细胞信号通路抑制OC的增殖[31]。GM失衡会导致IGF-1、GLP-1、GLP-2水平降低，从而间接影响OB、OC的功能和数量，最终导致OP[32]。

3.3.3血清素：血清素同神经递质一样在大脑中产生，其直接靶标是OB，血清素与血清素受体(主要是Htr1b)结合，可抑制Htr1b/PKA/CREB/细胞周期蛋白信号传导，通过促进骨形成和抑制骨吸收而对OP产生积极影响[33]。

3.3.4瘦素：瘦素是一种来源于脊椎动物双细胞的激素，可调节骨量、能量消耗和食欲等生理过程。一些证据表明微生物群与瘦素水平有关：使用万古霉素可导致大鼠瘦素水平急剧下降；大量细菌种类(如乳球菌、黏液螺旋菌、乳杆菌和双歧杆菌)与周围瘦素水平呈正相关；而其他细菌种类(如梭菌、普氏杆菌、拟杆菌和同种异位菌)与瘦素水平呈负相关[34]。当瘦素与瘦素受体(leptin receptor，ObRb)结合可抑制血清素的合成与释放[35]，因此GM失衡可最先影响瘦素从而减少血清素，抑制骨形成和促进骨吸收，导致OP形成。

3.3.5甲状腺激素：GM通过调节葡萄糖醛酸苷酶和硫酸盐活性来影响甲状腺素的肝肠循环[36]。在甲状腺素中，降钙素(由甲状腺C细胞分泌)可以抑制甲状旁腺素，从而减少骨动员，促进OC凋亡，并延迟OP的发作。

3.4 其他

一氧化氮合酶(NOS)：GM可以驱动致病菌或细菌脂多糖诱导的NF-κB与诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)启动子结合，从而上调iNOS的转录；在机械应力作用下，iNOS可增加OB数量，但同时也可通过增加RANKL水平促进OC的产生[37]。GM还促进内皮NOS(endothelial NOS，eNOS)的释放，eNOS mRNA可调节骨细胞的产生、炎性介质的释放(例如TNF-α、IL-1、IL-6)[38]。在NOS缺乏的大鼠中，骨小梁矿化和软骨细胞功能降低；而iNOS缺陷大鼠比eNOS缺陷大鼠发展出更严重的OP，这表明GM主要通过影响iNOS活性来维持骨稳态[39]。

同型半胱氨酸：肠道菌群失调导致空肠中叶酸的吸收减少，导致高同型半胱氨酸血症；高同型半胱氨酸血症不仅会导致细胞外基质降解和骨血流量减少，而且还会对骨骼健康产生有害影响[40]。

4 GM相关疗法与展望

高纤维益生菌补充剂、SCFA饮食和粪便微生物移植(fecal microbial transplantation，FMT)是研究最多的疗法，它们均具有抗炎作用，并能维持肠道菌群的平衡。其中以SCFA饮食疗法研究较多[41]：①SCFA促进Treg发育并刺激Treg免疫反应，从而减弱由GM引起的免疫系统异常；②SCFA可降低肠道pH值，增加钙结合，上调蛋白质转录和维生素D受体水平来增加钙的吸收。FMT是一种将粪便及其相关微生物群从健康的供体中取出并放置于接受者体内的方法，现已成为人类艰难梭菌感染的公认治疗方法，也有研究报道FMT在动脉粥样硬化、肥胖症和肿瘤疾病中可能有效[42]；而骨病可能成为简化FMT程序的另一种应用，推测未来可能会在个性化药物的发展方面对重度OP患者的微生物群进行分析，并尝试通过饮食、益生元、益生菌或FMT将微生物群转变为更具骨骼保护性的成分。总之，GM可以通过影响宿主代谢、免疫力和内分泌环境来调节骨代谢，这可能为OP的新预防和治疗策略提供了理论基础，并为OP的免疫调节和靶向治疗提出了新的思路。但是，GM与OP的关系仍需要进一步研究，尤其是特定微生物在OP中的作用以及来自实验动物研究的观察数据需要在人类研究中进一步验证。