抗纤灵对慢性肾功能衰竭模型Smad2-KO小鼠心脏CoI、CoIII、AngII、TNF-α、IL-6 的影响*

夏 嘉，王 颖，刘铭洁，高雅婵，陈文浩，何立群△

1 上海中医药大学附属市中医医院，上海200071；2 上海中医药大学附属中西医结合医院；3 贵阳中医学院第一附属医院；4 上海中医药大学附属曙光医院

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是指在各种致病因素影响下产生持续三个月或三个月以上的肾脏结构和功能的改变，是现今发病率较高的一种疾病。如果CKD 不能被早发现、早治疗将很快进展至慢性肾功能衰竭（chro-nic renal failure，CRF），若肾单位和肾功能持续进行性丧失，会引发心血管并发症，严重危害人类健康。即便在CKD 早期，心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的患病率和死亡风险已明显增加，有的患者在进入终末期肾病之前就已死于CVD［1］。故而如何有效防治CKD 引起的CVD，减少全因死亡率，已逐渐成为近年来全球性的重要医疗课题。Smad2 基因作为TGFβ1/Smad 通路的重要成员，对心、肾纤维化起着不可忽视的作用。本研究旨在观察抗纤灵对Smad2-KO的CRF小鼠心脏病变的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择59 只SPF 级肾脏上皮细胞Smad2-KO 小鼠，体质量18～21 g，种鼠来自美国JACKSON实验室，由上海南方模式生物研究中心培育繁殖并分笼饲养，实验动物合格证号：SCXK（沪）2014-0002，小鼠在室温26℃、相对湿度45%、人工12 h昼/夜循环照明环境中自由进食饲料和饮水。

1.2 实验药物抗纤灵药物组成：桃仁12 g，丹参15 g，当归12 g，酒大黄9 g，怀牛膝15 g，由曙光医院中药房提供，煎煮20～25 min。缬沙坦胶囊（北京诺华制药有限公司，国药准字号H20040217，规格：80 mg/粒）。

1.3 仪器与试剂AngII 酶联免疫吸附试剂盒（武汉华美生物有限公司，批号：G11099685）；BCA蛋白定量试剂盒、兔抗小鼠CoⅠ、CoⅢ、TNF-α、IL-6多克隆抗体及二抗HRP标记的IgG（武汉博士德生物技术公司，批号：24561、53940、78326、10517、81109、17813）；Mini Protean Cell 垂直电泳仪和转膜仪（美国伯乐Bio-Rad 公司）；PVDF膜（美国Millipore 公司）；X 射线胶片（美国柯达公司）；Multiskan Ex 型酶标仪（上海科夷生物技术有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 造模及分组 1）假手术方法：打开肾区皮肤肌肉并暴露肾脏后再缝合伤口。将18 只假手术Smad2-KO 小鼠随机分为假手术组、抗纤灵假手术组、缬沙坦假手术组，每组6 只。2）CRF 小鼠造模方法采用国际公认的5/6 肾脏切除手术进行（platt法）。41只Smad2-KO小鼠在第一次造模至造模2周测定血肌酐之前共死亡17只。造模成功标准：2 周后小鼠眼眶取血测肌酐，若结果高于假手术组（P＜0.05）判定为造模成功，结果造模成功24 只。将24 只CRF 模型Smad2-KO 小鼠随机分为模型组、抗纤灵模型组、缬沙坦模型组，每组8只。

1.4.2 给药方法 根据动物实验中小鼠与人的体质量计算比例，按照20 g/kg把抗纤灵复方配成水煎剂，灌胃前用蒸馏水将药液稀释成相应的比例，抗纤灵假手术组、抗纤灵模型组小鼠分别予抗纤灵复方0.5 mL，每天灌胃。缬沙坦假手术组、缬沙坦模型组按照缬沙坦的剂量为20 mg/kg配制成混悬液，每天予0.5 mL缬沙坦灌胃。模型组、假手术组小鼠则每天分别予0.5 mL蒸馏水灌胃。

1.4.3 取材 六组小鼠灌胃8 周后取材。至实验结束时，假手术各组Smad2-KO 小鼠未见死亡，模型组、抗纤灵模型组、缬沙坦模型组各有2 只小鼠死亡。各组小鼠眼球摘除取血后，迅速剪开胸廓，取心脏，生理盐水洗净，吸干多余水分，剪取一部分左心室放入4%多聚甲醛中行HE染色，剩余部分心脏放入冷存管，存放于-80℃冰箱备用。

1.5 小鼠心脏AngⅡ的表达从-80℃度冰箱中取出心脏组织并加9倍的PBS，在冰水浴中用玻璃研磨器研制成10%的匀浆，以离心半径：13.5 cm，3500 r/min，离心10 min，取上清液，根据血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）的Elisa 试剂盒说明书步骤操作。

1.6 小鼠心脏CoⅠ、CoⅢ、TNF-α、IL-6的表达采用免疫印迹（Western blot）法测定I 型胶原（collagen I，CoI）、Ⅲ型胶原（collagen Ⅲ，CoⅢ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）的蛋白表达。-80℃低温保存的心脏组织约20 mg，加入200 mL RIPA裂解液，匀浆研碎，离心半径：16 cm，10 000 r/min，离心5 min，离心取上清，BCA 法测定蛋白浓度，制成含蛋白量相等的上样液，行SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳。然后将蛋白电转到PVDF 膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS 封闭，加入一抗，4℃孵育过夜；然后TBST 洗膜5 min，3 次，加入HRP 标记的二抗室温下摇床上孵育2 h；TBST 洗膜15 min，5次，按化学发光检测试剂盒说明书显影、定影，用Photo shop 测定各蛋白的相对光密度值（目的条带灰度/内参条带灰度）。

1.7 统计学方法采用SPSS 13.0 软件进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验或Tamhane，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠心脏HE 染色假手术组、缬沙坦假手术组、抗纤灵假手术组的心肌细胞结构均正常，心肌排列整齐。模型组可见心肌细胞肥大，心肌排列紊乱、间质结缔组织增生；抗纤灵模型组、缬沙坦模型组心肌细胞肥大、排列紊乱及间质结缔组织增生的情况均较模型组减轻；缬沙坦模型组心肌细胞肥大改善更明显。见图1。

2.2 小鼠心脏CoⅠ、CoⅢ、TNF-α 及IL-6 相对表达量Smad2-KO 小鼠假手术组、缬沙坦假手术组、抗纤灵假手术组组间比较，CoⅠ、CoⅢ、TNF-α、IL-6的相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组与假手术组比较，Smad2-KO 小鼠模型组的CoⅠ、CoⅢ、TNF-α 及IL-6 的相对表达量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；治疗后，抗纤灵模型组与缬沙坦模型组均能明显改善Smad2-KO小鼠CoⅠ、CoⅢ、TNF-α 及IL-6 的相对表达量，差异有统计学意义（P＜0.01），且两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1，图2—3。

2.3 小鼠心脏AngⅡ含量与假手术组比较，抗纤灵假手术组的AngⅡ无显著变化（P＞0.05），缬沙坦假手术组的AngⅡ下降（P＜0.05），模型组小鼠的AngⅡ含量则明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，抗纤灵模型组能改善Smad2-KO小鼠心脏AngⅡ的含量（P＜0.05），缬沙坦模型组能明显改善Smad2-KO 小鼠心脏AngII 的含量（P＜0.01），缬沙坦模型组在改善AngII 方面优于抗纤灵模型组（P＜0.05）。见表1。

图1 各组小鼠心脏HE染色结果（HE×400）

表1 各组Smad2-KO小鼠心脏CoI、CoIII、TNF-α、IL-6的相对表达量及AngⅡ含量比较（χ±s）

图2 Smad2-KO小鼠心脏CoⅠ、CoⅢ的相对表达量

图3 Smad2-KO小鼠心脏TNF-α、IL-6相对表达量

3 讨论

对中医而言，“虚”是CRF 引起CVD 的总病机，与心、脾、肾三脏相关，病理因素多涉及瘀血、湿浊、毒邪等。上海市名中医何立群教授认为：CRF的中医发病机制的根本在于久病及肾、久病多虚，而久病入络、久病必瘀乃本病的标实之所系。血液动力学的改变、凝血机制的激活、纤溶系统以及体液和交感神经系统的异常等都可导致血流不畅、瘀血内生，从而引起或加重心室重构的发生发展。据此，何教授提出了活血化瘀、补肾通络为主治疗本病的原则并创立了抗纤灵复方。

Smad2 蛋白同Smad3 蛋白相类似，Smad2 被认为是TGF-β 诱导的血管平滑肌细胞转录因子的特定前体，它决定了血管平滑肌细胞是来源于中胚层或来源于神经脊细胞的生理上差异［2-3］。Smad3是导致肾脏炎症和纤维化的关键因子，Smad2 和Smad7 则具有肾脏保护作用，Smad2 可能通过竞争性地抑制Smad3 磷酸化和核转录起到抗肾脏纤维化的作用。肾脏Smad2基因的缺失增加了TGF-β1/Smad3 介导的胶原基质的表达和其它诸如肾素、AngⅡ、ACE等致纤维化因子［4-5］。通过多个动物实验，我们发现抗纤灵能抑制野生型和Smad2-KO 的CRF 模型小鼠肾组织RAS 及TGF-β1/Smad 通路的过度表达，减少细胞外基质的积聚，抑制胶原纤维的增生，具有改善肾纤维化、保护肾功能的作用［6-7］。那么抗纤灵对于肾上皮细胞Smad2-KO小鼠的CRF心室重构是否仍有作用，本研究结果显示肾上皮细胞Smad2-KO 小鼠本身并没有心脏结构的变化，需进行platt 法造模后才会出现心室重构。对CRF 小鼠诱导的心室重构模型进行中药干预后，抗纤灵能改善Smad2-KO 的CRF 小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱及间质结缔组织增生的情况，并能降低心脏CoⅠ、CoⅢ、AngⅡ、TNF-α 和IL-6 的表达，起到改善心室重构的作用。

抗纤灵组成中丹参在药理学上具有降低血黏度、改善血液流变学、抗血管硬化［8］及抗菌消炎、减轻心脏负荷、保护心肌细胞［9］、抗心律失常和抗氧化等方面的作用［10］。刘文举等［11］用丹参酮ⅡA治疗心肾综合征患者，得出该药可改善心肾综合征患者全身炎症状态，降低血浆CRP、IL-6、TNF-α的水平，改善心肾功能的结论。大黄则有一定的强心、降血压的作用［12］。秦志平［13］证实大黄水煎剂可改善心力衰竭患者的心功能、逆转心室重构，又可降低左心衰大鼠的BNP 并抑制其心脏扩大、提高收缩力。池雪林等［14］报道，随着牛膝多糖用药浓度的增加牛蛙心肌收缩能力也随之增强，二者的量效关系明显。当归可以抗心律失常、抑制心肌细胞肥大［15-16］和降低血压，其降压作用可能通过抑制AT1R 基因的表达和调节ERK1/2 的通路实现［17］。本研究结果表明，抗纤灵改善Smad2-KO CRF 小鼠心室重构的机制可能与降低心脏CoⅠ、CoⅢ、AngⅡ和炎症因子的表达有关。