丹酚酸B 通过下调细胞凋亡及炎性损伤减轻高糖诱导的RSC96 细胞损伤*

王倩倩，孙连庆

西安交通大学第一附属医院,陕西 西安710061

糖尿病周围神经病变是糖尿病患者出现神经功能障碍体征或症状的一类并发症，主要表现为感觉、运动功能障碍，严重影响患者的生活质量［1-4］。但目前有关糖尿病周围神经病变的发病机制尚未阐明，尚缺乏有效的治疗手段。丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）是丹参的有效水溶性成分，具有抗氧化、清除自由基、抗凋亡、抗炎等作用［5-10］。本研究通过离体实验观察Sal B 对HG 培养的雪旺细胞增殖活性、凋亡及炎性因子表达的影响，探讨Sal B 是否通过抑制细胞凋亡及炎性损伤对糖尿病周围神经病变起到防治作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞大鼠雪旺细胞系细胞（rat schwann cell line，RSC96）是一种永生化的大鼠雪旺细胞，购自美国模式培养物集存库ATCC，由陕西藩胜生物科技有限公司上海办代为采买。

1.2 药品及试剂D-葡萄糖、Sal B、噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma，美国）；低糖培养基、HG 培养基（Hyclone，美国），Annexin V-FITC（七海生物，中国）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，中国）；兔抗大鼠Bax，Bcl-2，P65，抗体（CST，美国）；白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）（Immunoway，中国）。

1.3 实验仪器CO2培养箱（上海普美达仪器有限公司，中国）；倒置相差显微镜（olympus，日本）；台式高速离心机（苏州华宇净化设备有限公司，中国）；酶标仪（BioTek，美国）；流式细胞仪（BD Biosciences公司，美国）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养及传代 复苏RSC96 细胞，加入DMEM培养基、胎牛血清（10%）、双抗，2～3天换液1次。待细胞长至瓶底80%～90%，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化，3～5 天传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

1.4.2 MTT 比色法检测OD 值 按照2000/孔的密度将RSC96细胞接种于96孔板，加入不同浓度HG培养基（5.6、25、50、75、100、125 mmol/L）及Sal B 1 μmol/L 作用72 h，每孔避光加入20 μL MTT 溶液，继续孵育4 h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔避光加入150 μL DMSO，避光振荡10 min，于酶联免疫检测仪选择490 nm波长测定各孔光吸收值（OD值）。

1.4.3 流式检测ROS 按照5×104/孔的密度接种于6 孔板，将实验分为低糖组（5.6 mmol/L），HG组（125 mmol/L），HG+Sal B 组（HG 125mmol/L+SalB 1 μmol/L），作用70 h，加入DCFH-DA 10 μmol/L，作用2 h，胰酶消化并收集细胞于流式机按照激发波长485 nm，发射波长525 nm 检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。

1.4.4 Western blot 检测凋亡及凋亡相关蛋白的表达 加入不同条件作用72 h，各组细胞标本加入细胞裂解液提取蛋白，将含有40 μg 蛋白上清液电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上，并将含5%脱脂奶粉进行封闭，一抗Bax（BCL2-Associated X，Bax），B 细胞淋巴瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），核因子κB P65（nuclear transcription factor kappaBP65，NF-κB-P65），IL-1β过夜孵育，TBST 洗膜3 次，二抗孵育1 h，采用ECL试剂盒检测，采用Image-pro图像分析定量。

1.5 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据统计，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，非正态分析数据采用非参数检验方法，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 OD值各组OD值随着糖浓度的增加而降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组OD值比较（±s）

表1 各组OD值比较（±s）

注：*表示与正常对照组比较，P＜0.05

组别对照组次数HG组OD值0.6656±0.0407 0.6472±0.0247 0.6054±0.0230 0.6582±0.0433 0.5782±0.0385*0.5196±0.0363*3 3 3 3 3 3 GS剂量（mmol/L）5.6 25 50 75 100 125

2.2 细胞增殖活力的抑制随着丹酚酸浓度的升高，丹酚酸B促进细胞增殖作用越明显。见表2。

2.3 ROS 含量HG 组与对照组比较，ROS 含量明显增加；HG+Sal B 中剂量组（HG 125 mmol/L+SalB 1 μmol/L）与HG组比较，ROS含量明显下降（P＜0.05）。见图1。

2.4 细胞凋亡及炎性相关蛋白的表达与对照组比较，HG组Bax、P65、IL-1β表达水平表达上升，Bcl-2 表达水平下调（P＜0.05）；与HG 组比较，HG+Sal B 中剂量组Bax、P65、IL-1β 表达水平下降，Bcl-2表达水平上调（P＜0.05）。见图2。

表2 各组对细胞增殖活力的影响（±s）

表2 各组对细胞增殖活力的影响（±s）

注：*表示与HG组比较，P＜0.05

分组对照组HG组HG+SalB高剂量组HG+SalB中剂量组HG+SalB低剂量组细胞增殖活力0.6670±0.0590 0.5876±0.4930 1.9870±0.0480*1.3982±0.0425*0.9832±0.0520*次数3 3 3 3 3剂量GS 5.6 mmol/L GS 125 mmol/L GS 125 mmol/L+SalB 10 μmol/L GS 125 mmol/L+SalB 1 μmol/L GS 125 mmol/L+SalB 0.1 μmol/L

图1 各组ROS含量

图2 各组凋亡及炎性相关蛋白的表达

3 讨论

氧化应激是糖尿病周围神经病变的重要发病机制，而HG 刺激是诱发细胞活性氧过量产生的重要原因。当周围神经组织暴露在HG 环境中时，葡萄糖顺浓度梯度转运到神经细胞内部，细胞内长期、慢性高血糖状态将导致氧化和抗氧化系统失衡。线粒体是ROS 的重要靶器官，而神经组织中线粒体含量丰富，因此，由氧化应激损伤造成的神经元和神经胶质细胞的凋亡最终可能导致DPN 的发生［10-11］。HG 可诱导氧化应激导致ROS 的累积。ROS 在炎性反应过程中发挥重要作用。ROS 可诱导线粒体通透孔开放，导致线粒体膜电位下降，并释放细胞色素C，继而激活NF-kB 等炎性信号通路，诱发炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18 的合成、释放，最终引起细胞损伤。

Sal B是丹参的主要药用成分之一，由三分子的丹参素和一分子的咖啡酸缩合而成。研究发现，Sal B可通过抗氧化活性缓解高脂饮食和链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠症状［12］；同时，Sal B可阻断神经元内氧化应激和线粒体障碍，对神经系统具有保护作用［13］。因此，我们推测Sal B可能通过抑制ROS 介导的细胞凋亡及炎性损伤保护周围神经。鉴于此，我们采用MTT 法检测细胞增殖活性，结果发现随着糖浓度的提高，RSC96 细胞增殖活性降低。继而检测了不同浓度Sal B 对HG 培养的RSC96 细胞增殖的影响，结果发现随着Sal B浓度的增加，RSC96 细胞增殖活性增加。采用流式法检测ROS 含量，结果发现高浓度葡萄糖可上调ROS，Sal B 可下调ROS；采用免疫印迹法检测凋亡、炎性因子相关蛋白的表达，结果发现HG 可增加凋亡、炎性因子相关蛋白的表达，Sal B 可减少凋亡及炎性因子相关蛋白的表达水平。

综上所述，Sal B 可通过抑制ROS 介导的细胞凋亡及炎性因子的表达保护周围神经。但目前有关Sal B 作用于动物模型及人体的实验尚待进一步研究。在今后的工作中可进一步研究印证Sal B对糖尿病周围神经病变保护作用。