慢性肾脏病患者血清微小RNA-210表达水平及其与颈动脉粥样硬化的关系

布海霞 徐可 王树龙

慢性肾脏病(CKD)患者易发生颈动脉粥样硬化，而颈动脉粥样硬化斑块的破裂、脱落所导致的急性心肌梗死、缺血性脑卒中等心脑血管不良事件是CKD患者的主要死亡原因[1-2]，因此，早期识别CKD患者颈动脉粥样硬化斑块的形成对预防心脑血管疾病的发生和延长生存期具有重要意义。微小RNA(miRNA,miR)为一种非编码短链RNA分子，通过与基因3’-UTR结合调控多种基因的转录和蛋白表达过程[3]。近年来研究发现，miR-210不仅能够调节血脂代谢过程，还能诱导内皮细胞凋亡、调节平滑肌细胞增殖等从而在动脉粥样硬化的病理生理过程中发挥重要作用[4-6]。本研究通过探讨CKD患者血清中miR-210的相对表达水平及其与颈动脉粥样硬化的相关性，分析miR-210在诊断CKD患者发生颈动脉粥样硬化中的临床效能。

对象与方法

1.对象：纳入2018年1月1日～2019年6月1日于新乡市中心医院和新乡医学院第一附属医院肾脏内科就诊的130例CKD患者为CKD组。CKD诊断标准参考肾脏病预后质量倡议(K/DOQI)指南。其中男88例，女42例，年龄43～62岁，平均年龄(55.24±8.25)岁；CKD 1期、2期、3期、4期和5期患者分别为19例、28例、36例、35例和12例；基础疾病中慢性肾小球肾炎64例，糖尿病肾病25例，慢性间质性肾炎5例，高血压肾病29例，慢性肾盂肾炎7例。排除标准：(1)多种因素导致的急性肾损伤；(2)CKD急性加重；(3)合并慢性肝病、恶性肿瘤及妊娠；(4)近1个月发生过急性心血管事件、感染、手术；(5)近3个月内使用过激素和免疫抑制剂。另选取35例健康体检者为对照组，其中男20例，女15例，年龄44～60岁，平均年龄(54.17±9.23)岁。两组受试者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P<0.05)，具有可比性。所有受试者均签署知情同意协议书。

2.方法

(1)一般临床资料收集：收集所有受试者的一般临床资料，包括性别、年龄、BMI、2型糖尿病及高血压病史、收缩压及舒张压。

(2)血生化指标检测：所有受试者均禁食12 h后抽取外周静脉血检测空腹血糖、糖化血红蛋白、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A(ApoA)、载脂蛋白B(ApoB)、Hb、白蛋白(Alb)、尿酸、血肌酐水平，计算估算的肾小球滤过率(eGFR)。

(3)血清miR-210表达水平检测：于清晨空腹抽取受试者外周静脉血3 ml并离心取上层血清，将其置入无RNA酶EP管中，并置入-80 ℃冰箱中保存。血清中总RNA采用Trizol法提取。委托上海生工生物工程有限公司合成miRNA-210和内参U6引物。根据miScript Ⅱ RT逆转录试剂盒进行逆转录反应(QIAGEN公司，德国)。采用miScript SYBR Green试剂盒进行miRNA-210定量逆转尿聚合酶链反应(RT-PCR)检测(QIAGEN公司，德国)。Ct值为反应孔的荧光信号达到设定阈值的循环数，血清中miR-210的相对表达水平为2-△Ct=CtmiR-210-CtU6。

(4)颈动脉内膜中层厚度(IMT)测量：采用彩色多普勒超声诊断仪对所有受试者的双侧颈总、颈内动脉进行检查，于颈总动脉分叉近端1 cm处后壁测量颈动脉IMT，各测量3次取平均值。颈动脉IMT<1 mm为正常，1.0 mm≤颈动脉IMT≤1.5 mm为内膜增厚，颈动脉IMT>1.5 mm为颈动脉粥样硬化斑块形成[7-9]。

结 果

1.两组受试者一般临床资料、实验室检查结果、IMT与miR-210相对表达水平比较：与对照组相比，CKD组患者LDL-C、尿酸、血肌酐、颈动脉IMT、miR-210相对表达水平均显著升高，而Hb、Alb、eGFR水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组研究对象基本资料的比较

2.不同颈动脉IMT的CKD患者血清miR-210相对表达水平比较：根据颈动脉IMT将130例CKD患者分为正常组44例、内膜增厚组49例和颈动脉粥样硬化斑块形成组37例，3组患者血清miR-210相对表达水平分别为1.62(1.21，1.94)、2.31(1.87，2.64)、2.83(2.59，3.04)；3组患者血清miR-210相对表达水平随IMT厚度增加而依次升高，组间比较差异均有统计学意义(P<0.001)。CKD 1期、2期、3期、4期和5期患者血清miR-210相对表达水平分别为1.39(1.21，1.64)、1.78(1.71，1.98)、2.25(2.01，2.54)、2.74(2.66，2.93)和3.28(3.04，3.44)，miR-210相对表达水平随分期增加而升高，组间比较差异均有统计学意义(P<0.001)。

3.CKD患者血清miR-210相对表达水平与实验室检查结果的相关分析：Spearman相关分析结果显示，CKD患者血清miR-210相对表达水平与IMT(r=0.425)、LDL-C(r=0.254)、血肌酐(r=0.647)均呈显著正相关(P<0.05)，与eGFR呈现显著负相关(r=-0.523，P<0.001)。

4.CKD患者颈动脉IMT危险因素分析：以IMT为因变量(IMT≥1 mm为1，IMT<1 mm为0)，将表1中的所有因素作为协变量进行logistic回归分析，结果显示，血肌酐、eGFR和miR-210均为CKD患者颈动脉IMT增厚的危险因素(P<0.001)。见表2。

表2 CKD患者颈动脉IMT危险因素分析

5.血清miR-210诊断CKD患者发生颈动脉粥样硬化的临床效能：将130例CKD患者miR-210的相对表达水平作为检验变量，以37例颈动脉粥样硬化斑块形成组患者miR-210的相对表达水平作为状态变量绘制ROC曲线，结果发现，血清miR-210诊断CKD患者发生颈动脉粥样硬化的ROC曲线下面积为0.902(95%CI0.835～0.942，P<0.001)。当截断值为2.31时，敏感度和特异度分别为93.24%和95.25%。

讨 论

动脉粥样硬化是CKD患者最主要的血管并发症，CKD促进了动脉粥样硬化的发生和发展。Palanca等[10]研究结果提示，轻度肾功能减退是导致动脉硬化和冠状动脉病变的危险因素，而Roy等[11]也发现即使在CKD早期，患者出现心脑血管并发症的风险也显著升高，由动脉粥样硬化引起的心脑血管不良事件成为CKD患者主要的死亡原因。然而，尽管多种因素如脂质代谢紊乱、氧化应激、高尿酸水平及CKD患者特有的因素如肾功能减退等均与动脉粥样硬化有关[12]，但具体机制目前尚不清楚。因此，寻找能反映CKD患者发生颈动脉粥样硬化的生物学标志物成为目前关注的重点。

MiRNA属于高度保守的非编码小RNA分子，不同miRNA参与了机体不同疾病的病理生理过程。此外，miRNA在血清或组织中较为稳定，易于检测，这也对深入研究miRNA作为疾病的诊断、预测预后及是否可成为靶向拮抗剂具有重要的临床意义[3]。MiR-210基因位于人类第11号染色体(11p15.5)，靶向基因多达50余个[13]。多项研究证实，miR-210与动脉粥样硬化的病理生理过程密切相关[14-15]。Raitoharju等[14]采用miRNA微阵列分析后发现，患者主动脉、颈动脉和股动脉粥样斑块中miR-210的相对表达水平与对照组相比显著升高；Li等[15]通过检测血清中miR-210相对表达水平也证实miR-210在下肢动脉硬化闭塞患者中呈高表达。本研究结果不仅发现CKD患者血清miR-210相对表达水平显著高于对照组，且miR-210相对表达水平在正常组、内膜增厚组和颈动脉粥样硬化斑块形成组患者中依次升高，组间比较差异均有统计学意义；进一步Spearman相关分析结果显示，CKD患者血清miR-210相对表达水平与IMT呈显著正相关，提示CKD患者血清miR-210相对表达水平在一定程度上可反映颈动脉粥样斑块的形成，且logistic分析结果也进一步证实miR-210是CKD患者颈动脉IMT增厚的危险因素之一。在机制上，Li等[5]研究发现，miR-210通过作用于磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)从而抑制磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号传导通路的激活，最终促进人主动脉内皮细胞的凋亡，而内皮细胞的凋亡可引起局部血管脂质的异常沉积，并最终形成动脉粥样硬化。此外，Sun等[16]研究发现miR-210能激活脑梗死兔模型缺氧诱导因子1α-血管内皮生长因子信号通路(HIF-1α-VEGF)，而HIF-1α-VEGF与动脉动脉斑块的形成有关[17]。因此，我们认为CKD患者颈动脉粥样硬化可能与血清miR-210表达上调有关，且miR-210是CKD患者颈动脉粥样硬化形成的危险因素。

为进一步探讨miR-210是否可作为诊断CKD患者发生颈动脉粥样硬化的一项血清学指标，我们采用ROC曲线分析后发现，血清miR-210在诊断CKD患者发生颈动脉粥样硬化的曲线下面积高达0.902，诊断敏感度和特异度分别为93.24%和95.25%，提示血清miR-210诊断效能显著，可作为诊断CKD患者颈动脉粥样硬化的一项血清学标志物。

综上所述，CKD患者血清miR-210相对表达水平显著升高，在发生颈动脉粥样硬化的诊断中有良好的应用前景，但其具体机制有待进一步研究。本研究也存在样本量不足等缺陷，以后仍需开展大型队列研究探讨血清miR-210相对表达水平与CKD患者预后的关系。