UPLC-MS/MS法测定小儿泻痢片中7种有效成分的含量

张峰，赵玉泉，李习莹（开封市食品药品检验所，河南 开封 475000）

小儿泻痢片是由葛根、黄芩、白芍、甘草等十味中药材经提取浓缩等工艺制成的片剂，其主要用于治疗小儿湿热下注所致的痢疾、泄泻[1]。小儿泻痢片的功效是多种活性成分共同作用的结果，其中有效成分葛根素能改善心肌代谢及血管微循环、扩张冠状血管[2]；黄芩苷可以抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用；厚朴酚与和厚朴酚具有抑制癌细胞转移、抗血小板聚集等作用[3]；盐酸小檗碱对痢疾杆菌、大肠埃希菌所引发的肠道感染具有抗感染作用；芍药苷具有平抑肝阳、养血调经、敛阴止汗、抗菌之功效[4]；甘草酸有抗炎、增强免疫力、抗冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和人巨细胞病毒等呼吸道病毒的功能[5]。因此，对小儿泻痢片主要活性成分进行多组分同时检测，可以全面反映其质量。

现行质量标准仅对黄芩苷进行质量控制，无法全面反映小儿泻痢片复方制剂的特点，也无法实现有效全面的质量控制。目前关于小儿泻痢片质量控制的研究较多[6]，但大多采用液相色谱法结合紫外检测器进行测定，且检测的活性成分仅为一个或几个，方法分离效果不佳、运行时间长、专属性差。近几年发现伪品刺果甘草与甘草混合售卖，原标准[1]尚未收载对甘草的鉴别试验，且尚无文献报道对小儿泻痢片中甘草的含量进行质量控制。因为甘草酸的浓度很低，无法采用HPLC 法进行定量分析。因中药制剂成分复杂，使用HPLC 法测定时待测组分很难有效分离，且分析时间较长致使峰宽过宽难以得到较好的峰形。因此，选择更高效灵敏的仪器来建立快速、准确、选择性好的检测方法十分必要。

UPLC-MS/MS 法有着专属性强、灵敏度高的特点，它能通过不同化合物的特征母离子和子离子的相对应使之抗干扰能力强[7]，同时实现分离和鉴定的作用，更好地解决复杂样品准确定性、定量的问题，故本文采用UPLC-MS/MS 法同时测定小儿泻痢片中葛根素、黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、厚朴酚、和厚朴酚与甘草酸7 种活性成分的含量，为小儿泻痢片的质量控制及评价提供参考。

1 仪器与试药

美国Waters 三重四级杆液质联用仪（ACQUITY UPLC H-Class Plus Xevo TQ-S Micro，离子源为ESI 源）；New Classic 电子天平（德国Mettler Toledo，十万分之一），KQ-300 GDV 超声仪（昆山超声仪器有限公司），优普ULUP 超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。甲酸、乙腈均为质谱纯（Fisher 公司），甲醇为色谱纯（默克公司），对照品芍药苷（批号：110736-201035，纯度：96.5%）、厚朴酚（批号：110729-201310，纯度：100.0%）、和厚朴酚（批号：110730-201614，纯度：99.3%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，纯度：96.2%）、黄芩苷（批号：110715-201016，纯度：93.3%）、盐酸小檗碱（批号：110713-201613，纯度：86.8%）、葛根素（批号：110752-201615，纯度：95.4%）（中国食品药品检定研究院），小儿泻痢片（糖衣片，片芯重0.17 g，批号：1911032、1912121、2001221，桂林三金药业股份有限公司）；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和质谱条件

色谱柱为phenomenex kinetex C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm），流动相为0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），流速为0.4 mL·min－1，梯度洗脱（0～0.5 min，10%B；0.5～2 min，70%～30%%B；2～7.5 min，20%～80%B；7.5～7.6 min，10%B；7.6～15 min，10%B），柱温为35℃，进样量为2 μL。

离子源：ESI 源，正负离子切换扫描，MRM模式；毛细管电压：3.2 kV，锥孔电压：50 V；离子源温度：150 ℃；干燥气温度：400 ℃，气体流量800 L·h－1；雾化器压力240 kPa；雾化气、干燥气均为N2，Ar 为碰撞气，质谱其余分析参数见表1。

表1 7 种成分的质谱参数Tab 1 MS parameters of 7 components

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液的配制 精密称取葛根素、芍药苷、盐酸小檗碱、厚朴酚、和厚朴酚与甘草酸对照品各约10 mg，分别置于10 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液，质量浓度均约为1 g·L－1；精密称取黄芩苷约10 mg，置20 mL 量瓶中，分别吸取上述6 种对照品储备液适量，置该量瓶中，用40%乙腈溶液稀释至刻度，作为混合对照品溶液①，其中葛根素、黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、厚朴酚、和厚朴酚与甘草酸的质量浓度分别为0.1010、0.5010、0.1024、0.2008、0.1022、0.0505 与0.0303 g·L－1。精密量取混合对照品溶液①2 mL，置100 mL 量瓶中，用40%乙腈溶液稀释至刻度，作为混合对照品溶液②，精密量取混合对照品溶液②1、2、3、5、10、15 mL 分别置于50 mL 量瓶中，用40%乙腈溶液稀释至刻度，制成系列浓度的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取本品20 片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取约0.2 g，置100 mL 锥形瓶中，加入50 mL 70%乙醇溶液，浸渍12 h 后，超声（500 W，40 kHz）提取30 min，上清液转移至200 mL 量瓶中，残渣加入30%乙醇溶液约50 mL，超声提取30 min，过滤，合并滤液，残渣用50 mL 30%乙醇溶液分次洗涤，最后用30%乙醇溶液稀释到刻度，精密量取续滤液5 mL，置50 mL 量瓶中，用40%乙腈溶液稀释至刻度，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.3 方法学

2.3.1 方法专属性试验 取“2.2.1”项下中间浓度的混合对照品溶液和“2.2.2”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果各组分峰形良好，无干扰成分。各待测组分的MRM 图谱见图1，二级质谱图见图2。

图1 对照品（a）和供试品（b）的MRM 色谱图Fig 1 Multiple reaction monitoring（MRM）chromatogram of the seven standards（a）and sample（b）

图2 小儿泻痢片中各组分的二级质谱图Fig 2 Secondary mass spectrogram of 7 components in Xiaoer Xieli tablets

2.3.2 线性关系的考察 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下条件进样，记录峰面积，用外标法计算，以7 个待测组分的质量浓度为横坐标，其对应的色谱峰峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，结果见表2。

表2 小儿泻痢片中7 种成分的线性关系Tab 2 Linear correlation of 7 components in Xiaoer Xieli tablets

2.3.3 重复性试验 取批号为1911032 的供试品6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进行测定，7 个待测组分测得含量的均值分别为葛根素0.4588 mg/片、黄芩苷2.671 mg/片、芍药苷0.4775 mg/片、盐酸小檗碱0.9765 mg/片、厚朴酚0.4669 mg/片、和厚朴酚0.2340 mg/片与甘草酸0.1367 mg/片，RSD值分别为葛根素1.5%、黄芩苷1.8%、芍药苷3.2%、盐酸小檗碱1.0%、厚朴酚1.7%、和厚朴酚2.3%与甘草酸1.6%，结果表明本方法重复性符合要求。

2.3.4 稳定性试验 取“2.3.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下条件在0、2、5、10、15、20、24 h 分别进样，记录峰面积，7 个待测组分峰葛根素、黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、厚朴酚、和厚朴酚与甘草酸，峰面积的RSD值分别为1.7%、1.9%、3.9%、1.3%、2.0%、2.5%和1.9%，结果表明各组分在24 h 内稳定。

2.3.5 精密度试验 分别精密吸取“2.2.1”项下中间浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下条件进样，连续进样7 次，记录峰面积，结果葛根素、黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、厚朴酚、和厚朴酚与甘草酸峰面积的RSD值分别为2.3%、1.7%、3.7%、1.6%、2.1%、1.9%和1.7%，表明该仪器精密度满足试验要求。

2.3.6 回收试验 分别取已知含量的批号为1911032 的供试品6 份，每份约0.11 g，精密称定，分别置200 mL 量瓶中，精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液①1、2 和3 mL，平行2 份，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下条件测定回收率。结果7 个待测组分的平均加样回收率分别为葛根素101.8%（RSD为1.2%）、黄芩苷99.8%（RSD为3.9%）、芍药苷95.5%（RSD为2.8%）、盐酸小檗碱106.9%（RSD为2.5%）、厚朴酚97.2%（RSD为3.8%）、和厚朴酚95.5%（RSD为3.4%）与甘草酸104.3%（RSD为3.6%）。

2.3.7 样品含量测定 取3 个批号的供试品各2 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下条件进行测定，含量测定结果见表3。

表3 含量测定结果(mg/片)Tab 3 Content determination (mg/片)

3 讨论

参考文献[8-10]中葛根素、黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、厚朴酚、和厚朴酚与甘草酸的提取方法有超声波提取法、浸渍法、回流提取法，提取溶剂也不尽相同。本文分别用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇及30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇结合超声提取法提取样品，发现采用同样含水量的甲醇和乙醇提取效率相当，但不同含水量的溶剂提取出来的待测组分差别较大。因乙醇无毒便宜，故本文采用乙醇作为溶剂，且考虑到苷类和黄酮类化合物有较高的水溶性，而其他组分使用70%乙醇溶液提取率最高，故综合考虑采用70%乙醇溶液和30%乙醇溶液分次提取。通过对比70%乙醇溶液浸渍12 h 后分次超声提取和回流提取，发现待测物含量无明显变化，故采用较为简便的浸渍12 h 后分次超声提取法。分别使用超声提取20 min、30 min、60 min，发现待测物超声提取30 min 时的含量与60 min 时的相当。综合考虑提取方法如下，样品用70%乙醇溶液浸渍12 h 后超声提取30 min，滤过，滤渣再用30%乙醇溶液超声提取30 min。

参考文献[11-15]采用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-10 mmol·L－1甲酸铵溶液进行梯度洗脱，发现各物质在乙腈-0.1%甲酸溶液中响应良好且有较好的峰形。由于在使用40%乙腈溶液稀释时溶剂效应最小，故选用40%乙腈溶液稀释样品。为保证本法具有合适的定量限，使用含量最低的甘草酸的质谱条件作为最优化条件，且根据响应值的高低采用了正负离子切换扫描的方式，采集模式选择MRM 对待测样品进行扫描，将丰度最大的子离子作为定量离子，保证了方法的专属性和准确性。

通过测定3 批样品的含量，发现每批待测组分的含量比值差别较大，药品的均一性和一致性难以保证，本文为标准提高提供了数据支撑。

本试验首次建立了UPLC-MS/MS 法同时测定小儿泻痢片中7 种有效成分的含量，本法节省溶剂、快速准确、灵敏度高、专属性强，为该药品质量标准的提高提供参考。