PDX模型在肝细胞癌研究中的应用*

张 鹏，蔡卫华

（1南通大学医学院，江苏226001；2南通大学附属南通第三医院普外科）

肝癌是世界范围内高死亡率的恶性肿瘤之一，肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌的主要类型，近半数病例发生在我国，与我国肝炎病毒高感染率相关。手术治疗是治愈HCC的唯一方法，但HCC发现常在疾病晚期，往往已失去手术机会。药物治疗成为晚期患者主要治疗手段，多激酶抑制剂索拉菲尼是晚期HCC的一线治疗药物，随着越来越多耐药现象的出现，促使人们寻找新的解决方法，近年来新型抗HCC药物不断问世，但患者预后仍不容乐观[1-2]。

预测性良好的实验模型能极大促进临床转化研究的顺利进行。人源肿瘤组织异种移植（patientderived xenograft，PDX）模型是指将源自患者的新鲜肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的一种异种移植模型。1969年RYGAARD等[3]将大肠癌患者的肿瘤组织移植到裸鼠皮下，成功建立了PDX模型。因为PDX模型成本高、样本获取有限等弊端，后来逐渐被肿瘤细胞系异种移植（cell-line-derived xenograft，CDX）模型取代。近几年研究发现肿瘤细胞系CDX模型不能准确反映肿瘤的异质性，导致临床前结果与实际临床结果有较大差异[4]，因而PDX模型又重新被重视起来。PDX模型较好地保留肿瘤特征，具有良好的临床预测性[2]，是目前最理想的肿瘤模型。本文重点介绍HCC PDX模型的建立方法、优缺点及其在肝细胞癌研究中的应用现状，并对其前景进行展望。

1 HCC PDX模型的建立

1.1 移植动物 HCC PDX模型需选用免疫缺陷小鼠。（1）裸鼠（nude mice）：裸鼠先天性胸腺缺陷，T细胞成熟障碍，B细胞功能低下，体内免疫球蛋白主要为IgM，免疫力较低，但体内固有免疫仍较完善，具有一定的移植排斥能力，在传代过程中使得原始肿瘤的一些异质性消失，总体成瘤率较低[5-6]。（2）重度联合免疫缺陷小鼠（severe combined immunodeficiency mice，SCID）：因16号染色体上DNA修复基因的突变，使得SCID小鼠T细胞和B细胞免疫功能几乎完全丧失，成瘤率较裸鼠高，但较完好的固有免疫使其实际运用受限[7]。（3）非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠：即非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt与重度联合免疫缺陷小鼠SCID杂交后的小鼠，既有SCID小鼠T、B淋巴细胞功能缺陷的特点，又具有NOD小鼠部分固有免疫功能降低的特点，其免疫缺陷程度更高，但寿命短，不适于较长时间的实验研究[5，7-8]。（4）NCG/NSG/NOG小鼠：指在NOD/SCID基础上敲除IL-2Rg基因的小鼠，系目前免疫缺陷程度最高的小鼠品系，免疫细胞分化成熟受阻，缺乏T、B、NK细胞，固有免疫和获得性免疫均受损，免疫程度低，稳定性好，生存期长[4]。NOD/SCID小鼠和NCG/NSG/NOG小鼠更适用于建立HCC PDX模型，移植成瘤率更高[8]。

1.2 移植部位 （1）皮下移植：操作简单易行，且能直观肿瘤大小，使用广泛。GU等[9]将患者手术切除的新鲜肿瘤组织植入SCID小鼠皮下，建立了一组HCC PDX模型，并证实在组织学和基因表达模式等方面与匹配的肿瘤组织高度一致。然而，皮下移植存在无法复现患者肿瘤生长微环境的复杂性，不能模拟转移行为等缺陷，以致在HCC转移及微环境对HCC生长影响等方面的研究受限[10]。（2）肾包膜下移植：该部位血供较丰富，基质含量较多，建瘤成功率也较皮下移植高。有研究将肿瘤组织移植到裸鼠肾包膜下，成功建立了PDX模型，免疫组织化学、肿瘤标志物等实验证实在病理形态和分子特征等方面与原发肿瘤保持一致[11-12]。由于肾包膜下移植操作难度较大，移植成功后不易观察和测量肿瘤组织的大小，对小鼠损伤大，该模型的发展受限[5]。（3）原位移植：将患者来源的肿瘤组织进行原位异种移植（PDOX），可以提供与匹配的肿瘤组织相似的微环境，且血供丰富，极大保留了患者肿瘤的特异性[5，13]。有研究将离体肿瘤组织制成悬液，将悬液注入小鼠肝脏，完成组织悬液PDOX模型，利用PET/CT和HE染色评估建模状况，证明组织形态学的一致性[13]。原位移植能较好模仿与匹配肿瘤相似的转移特征，是目前最为理想的移植方式，但相较异位移植方式，其技术、成本及肿瘤评估等问题影响其广泛应用[14-15]。

1.3 影响移植成功的因素 PDX模型的成功构建与多种因素有关，除上述移植动物及移植部位外，肿瘤恶性程度越高、组织中肿瘤细胞比例越大、组织离体时间越短，PDX模型越易构建成功[2，5，14]。

2 HCC PDX模型的优势

CDX模型是将肿瘤细胞系移植到免疫缺陷小鼠皮下、肾包膜下或原位，但肿瘤细胞系是通过体外筛选、人工纯化、体内体外多次传代而建立的稳定细胞系，已丧失原始肿瘤组织的异质性，无法准确反映原始肿瘤的特征[6，16]。相对于CDX模型，PDX模型显示以下优势：（1）直接将患者新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，较完整保持肿瘤组织生物学特性，因此临床预测性更好；（2）可用于活体肿瘤的保存和传代，为肿瘤研究提供大量标本；（3）保留了肿瘤间质，肿瘤生长微环境更接近原代肿瘤的生长情况，利于肿瘤微环境对肿瘤细胞影响的研究；（4）PDX模型来源于不同患者，极大促进精准医学和个体化用药的发展。

3 HCC PDX模型的应用

3.1 HCC生物学机制的研究 作为高度复杂的异质性疾病，HCC发病机理及关键驱动因素目前尚未完全阐明，PDX模型的研发和应用极大地促进相关机理的研究。目前研究表明，多种信号通路的失控导致HCC的发生发展，其中Wnt/β-catenin途径在HCC发病机理中起着重要作用。免疫组化等研究证实，大多数HCC细胞系和患者来源的异种移植物（PDX）均显示β-catenin被激活，对HCC细胞系敲除β-catenin，使用siRNA处理HCC细胞系后，功能实验表明HCC细胞系对β-catenin的致癌依赖性与其在细胞系中的激活状态有关。随后研究者通过HCC肿瘤异种移植物，确定β-catenin在体内维持HCC的重要作用，为开发靶向治疗的新策略提供理论基础[17]。PDX模型与原始肿瘤具有高度相似性，传统细胞系和实验模型发现的生物学机制可以在PDX模型中验证，有助于尽早阐明HCC相关机理。

3.2 研究抗HCC药物耐药性，探寻治疗新策略 由于索拉菲尼耐药病例的不断增加，研究者一直致力于开发能取代索拉菲尼的新型抗HCC药物[6]。探索索拉菲尼耐药机制，探寻HCC治疗新策略是目前HCC研究新方向[18]。低异质性的细胞系不利于索拉菲尼耐药性研究，而基于患者新鲜肿瘤组织的PDX模型有望更有前景。有研究成功建立了16个HCC PDX模型，分别对索拉菲尼敏感和耐药进行研究，通过分析两者表达谱的差异，确定KPNA3为引起HCC进展和索拉菲尼耐药的潜在分子，进一步研究发现，KPNA3通过激活AKT-ERK轴上调TWIST表达，从而促进上皮-间质转化，导致HCC细胞对索拉菲尼的耐药性[18]，这项研究提供了抗KPNA3与索拉菲尼联合治疗新策略。另外，有研究者成功建立了耐索拉菲尼的体外HCC细胞和体内HCC PDX模型，耐索拉菲尼细胞明显表现出肿瘤原始细胞特性，并且肿瘤起始细胞标记物CD47显著上调。体外HCC细胞和体内HCC PDX模型均证实耐索拉菲尼的HCC细胞激活核因子κB，核因子κB通过CD47启动子中的特定反应元件调控CD47表达。敲除CD47和使用抗CD47抗体，对索拉菲尼敏感性增加，并在HCC PDX模型中证实抗CD47和索拉菲尼联合应用具有协同治疗作用[19]，为HCC治疗提供抗CD47联合索拉菲尼的新策略。

3.3 抗HCC药物的研发 抗癌药物开发的主要问题之一是临床前实验与临床结果相差甚远，大量临床前药物最终不能用于临床，药物应答率与临床结果相近的PDX模型有望改变这一现状。抗HCC药物研发和临床前实验是目前HCC PDX模型最广泛的用途[20-24]。有研究对HCC高选择性小分子MET抑制剂AMG337进行临床前评估，证实AMG337在体外具有抗HCC细胞系增殖活性，AMG337敏感性及MET扩增与蛋白质过表达呈强相关性；分析在AMG337处理HCC PDX样本后MET扩增与蛋白质过表达的发生率，以及在建立的MET扩增与蛋白质过表达的HCC PDX模型中AMG337的抗肿瘤活性，有助于为MET驱动的肝细胞癌患者提供治疗策略[23]。由于成本高、样本获取有限、模型建立成功率低，阻碍PDX模型的抗HCC药物研发，目前已有研究人员建立了肝癌PDX公共数据库和PDX模型衍生的细胞系[25-26]，用于解决上述问题，有助于更便捷地进行HCC相关研究。

3.4 生物标志物及治疗靶标的鉴定 识别肿瘤组织或癌旁组织中特异性表达的生物标志物，并通过与临床结果有高度一致性的实验模型加以证实，对于HCC早期诊断、预后判断及靶向治疗的发展至关重要[27]。目前，PDX模型已逐渐用于寻找HCC生物标志物及治疗靶标的研究中[18，27-29]。一项肿瘤标志物的研究检测74个肿瘤组织和癌旁组织的基因表达，识别出HCC组织中高表达的标志物CD133和CD44，并通过对患者的随访对其预后进行评估，并与HCC PDX模型得出一致结果[27]，表明CD133和CD44具有临床预后判断价值，也证实PDX模型对临床结果的预测作用，提示PDX模型在转化研究中的价值。

3.5 指导个性化治疗 不同HCC患者存在分子差异，对同一种治疗的敏感性不同，因此，应用个性化肿瘤移植模型指导治疗决策的研究正在兴起[8]。源于患者肿瘤组织的PDX模型较好保留原发肿瘤的特征和相似的生物学行为，反映不同患者的特征[30]。在一项研究中成功建立了6例HCC PDX模型，对其中1例进行索拉菲尼的药效学评价，并在临床同步使用索拉菲尼，结果表明索拉菲尼对该患者疗效不佳，提示PDX模型实验结果能反映体内原发肿瘤的药敏结果[2]，显示PDX模型指导个性化治疗的前景。

4 结语与展望

目前，PDX模型正逐渐取代传统CDX模型的地位，研究者们正不断尝试将PDX模型运用到包括HCC在内的各种实体瘤的研究中，尽力使得研究结果更接近实际情况。但PDX模型仍存在一些缺陷：（1）组织样本获取有限：PDX模型直接取自手术患者，需要得到伦理委员会批准及患者知情同意；（2）实验动物免疫缺陷：PDX模型建立需要重度免疫缺陷动物，在一定程度上限制了HCC免疫系统相关研究及免疫治疗药物的研发；（3）移植技术要求高：PDX模型的建立需要手术者、组织病理学专家及研究者的密切配合，最终移植成瘤率较传统CDX模型低；（4）建模费用高，周期长。研究者一直致力于克服上述缺陷，例如重建人免疫系统+人源肿瘤组织异种移植动物模型、PDX模型数据库不断完善、基于穿刺活检建立的HCC PDX模型的研究、体外培养PDX模型衍生细胞等，以完善PDX模型。