不同浓度氯胺酮多次暴露对斑马鱼发育及远期效应的影响*

殷艺娜，马 敏，芮琳琳，常俊晓

（1南京医科大学附属常州妇幼保健院麻醉科，江苏213003；2南通大学附属医院）

氯胺酮（Ketamine）作为N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的非竞争性拮抗剂，是既能镇静又能镇痛的全麻药物，广泛应用于产科和小儿外科手术麻醉中[1-2]。婴幼儿处于神经系统发育期，是神经系统最脆弱、最容易受到损害的时期，全身麻醉药是否影响患儿的大脑发育及学习记忆一直是人们关注的热点[3-4]，氯胺酮是否对发育期大脑产生神经毒性作用，是否对婴幼儿远期发育及学习和认知功能产生影响存在较多争议。斑马鱼体外受精胚胎透明、发育快速、繁殖力强，其生长发育过程、组织系统结构与人类有很高的相似性，在基因和蛋白质结构和功能上具有很高的保守性，广泛用于神经发育生物学、神经损伤与退行性变、毒理、肿瘤、其他系统发育及疾病等多方面研究[5]。从20世纪60年代已有学者研究斑马鱼行为学，近20年斑马鱼作为模式动物在发育及药物毒理等领域得到更多的关注和研究[6]。

本研究以斑马鱼为实验动物模型，通过观察其生长发育形态、自由运动、惊恐反射活动和T迷宫等行为学反应，探究不同浓度氯胺酮对斑马鱼胚胎、幼鱼及成鱼的神经毒性作用，为氯胺酮在婴幼儿麻醉中的安全用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 AB品系野生型斑马鱼，饲养和繁殖主要参照The Zebrafish Book[7]。光照/黑暗周期控制在14 h∶10 h，室温与水温控制在（28.5±1）℃。在实验前1日下午将7～10月龄成鱼［雌∶雄（1～2）∶2］放入交配缸，用透明隔板将雌雄鱼隔开，实验当天上午9时取走隔板，30～60 min后收集胚胎，挑去死亡（肉眼观察下胚胎发白）鱼卵，系统水清洗2遍后放入含有幼鱼孵化液的培养皿中，置28.5℃孵化箱中孵育。参照KIMMEL等[8]描述的发育阶段，在体式显微镜下剔除形态发育异常的胚胎，孵育至受精后24小时（24 hour post fertilization，24 hpf）时挑选形态正常的鱼卵用于实验。

1.2 实验试剂与仪器 试剂：盐酸氯胺酮注射液（福建古田药业有限公司），斑马鱼幼鱼孵化液（E3溶液，含5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4）。仪器：斑马鱼养殖系统（北京爱生生物科技发展有限公司），体式显微镜（南京保利华科学器材有限公司），Noldus Ethovision X11.5斑马鱼视频跟踪系统（含T迷宫装置，荷兰）。

1.3 生长发育毒性实验 氯胺酮暴露浓度选用0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL，暴露时间分两个阶段，24～36 hpf和48～60 hpf。将24 hpf斑马鱼胚胎随机分为5组，即对照组（E3溶液）及4个不同浓度（0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL）氯胺酮组，每组50±10枚胚胎，实验重复20次。分别在36 hpf和60 hpf时将处理组斑马鱼用系统水清洗2遍后全部更换为孵化液，对照组在48 hpf更换一半孵化液。以卵凝结和心脏停跳作为死亡终点，分别于72 hpf和6 dpf在体式显微镜下观察记录胚胎和/或脱膜后幼鱼的死亡数、畸形数及幼鱼孵化数，统计每组死亡率、畸形率和孵化率，并记录主要畸形特征。

1.4 幼鱼自由运动分析 幼鱼发育至6 dpf时，在体式显微镜下将外观正常的幼鱼逐条移入24孔板，每孔1条，放入Noldus幼鱼运动行为监测仪内适应5 min后，应用Ethovision XT 7.0软件控制视频跟踪系统，采集3 min幼鱼自由运动视频，导出其总运动距离、平均运动速度等参数，实验重复3次。实验选择在幼鱼运动处于平台期时段（12:00～15:00）进行，观察不同浓度氯胺酮暴露对幼鱼运动轨迹和运动参数的影响。

1.5 幼鱼对强光刺激的惊恐反射活动 幼鱼在Noldus幼鱼运动行为监测仪内适应5 min后，运用Ethovision XT 7.0软件设置5 min暗-1 min光照-5 min暗，采集11 min内幼鱼的运动视频，以光照期间以及光照结束后恢复期内运动距离的变化作为神经行为学评价指标，观察氯胺酮暴露对幼鱼惊恐反射活动的影响，判断幼鱼视觉或感觉运动高级神经回路的损伤情况。本实验时间时段为18:30～20:00。

1.6 成鱼T迷宫实验 测试方法参考文献[9]并略加改进。T型迷宫由不透明的树脂材料制成，主要由1个长臂（50 cm）和2个短臂（20 cm）构成，臂宽10 cm，深10 cm，水位8 cm。在短臂一侧连一个矩形水槽（22 cm×20 cm×15 cm），水槽外壁为黑色树脂，内有鱼食。考虑到斑马鱼为群居动物，在水槽内放置一个透明玻璃烧杯，杯内放4条成年斑马鱼，以吸引被测试斑马鱼，将此区域称为富营养区（enriched chamber，EC)。行为学测试前2天，将60 dpf成年斑马鱼放在T迷宫长臂适应1 h，测试共5天，测试时间为10:00～17:00，每条鱼每次测试5 min。测试开始时将1条测试鱼置于长臂起点，记录斑马鱼从起点到进入EC区的潜伏时间（只有完全进入EC区并停留超过20 s，才认为是真正进入EC区)。找到EC区后在EC区内奖赏50只丰年虾食物，观察是否在EC区停留超过20 s。未找到EC区的斑马鱼，5 min测试完后将其引导进入EC区，使其在EC区停留1 min。每条鱼测试后放入有编号的透明独立容器中，在测试期间被测试斑马鱼只有在EC区给予食物。

1.7 统计学处理 应用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，运用GraphPad Prism 6软件生成统计图表。计量资料以Mean±SD表示，多组比较采oneway ANOVA或two-way ANOVA，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度氯胺酮暴露对斑马鱼幼鱼形态发育的影响 在0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL氯胺酮组，从72 hpf至6 dpf胚胎生存率均高于99%，与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。如图1D（封二）所示，氯胺酮暴露浓度≥0.4 mg/mL时，72 hpf和6 dpf各组致畸率明显升高，与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。畸形主要表现为头部和鳃发育不良、脊索弯曲、短尾、卵黄突出、心包水肿并伴有细胞沉积等（图1B、C，封二）。根据文献[10]，氯胺酮麻醉使用剂量0.2 mg/mL为亚麻醉剂量，0.4～0.8 mg/mL为临床麻醉剂量，1.6 mg/mL为高于临床麻醉剂量。本实验结果表明临床麻醉剂量及高于临床麻醉剂量的氯胺酮早期长时间暴露对斑马鱼胚胎和幼鱼的发育有致畸效应。

2.2 不同浓度氯胺酮暴露对幼鱼自由活动的影响 幼鱼3分钟自由运动结果显示，各氯胺酮组幼鱼运动距离和运动速度均高于对照组，以0.4 mg/mL氯胺酮组升高最明显，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图2A、B，封二），提示氯胺酮对幼鱼的自由运动产生兴奋效应，此现象与氯胺酮临床不良反应如诱发惊厥或因植物神经功能紊乱诱发的烦躁症状类似。幼鱼自由运动轨迹如图2C所示，与对照组相比，氯胺酮暴露组幼鱼自由运动轨迹增多、紊乱，并伴有刻板式转向。

2.3 不同浓度氯胺酮暴露对光照诱发惊恐反射的反应和适应能力影响 在转移至黑暗环境中适应一段时间后，斑马鱼幼鱼表现为静息或平稳游动。如果突然给予强光照射，正常幼鱼对外界刺激的反应表现为迅速静止不动或游动速度明显降低，而撤除光源后，幼鱼最初表现为运动活跃，后又逐渐减慢。如图3所示，氯胺酮暴露浓度≤0.4 mg/mL时，幼鱼在光照期的运动距离小于黑暗期，与对照组类似，差异无统计学意义（P＞0.05）；而1.6 mg/mL氯胺酮组幼鱼在强光刺激后表现出运动增强，其运动距离大于黑暗期，差异有统计学意义（P＜0.05），表明高浓度氯胺酮暴露后，可能导致斑马鱼对光线变化反应敏感，但也不排除其对幼鱼视力产生影响。与对照组相比，光刺激后进入黑暗期1 min内，0.4 mg/mL氯胺酮组幼鱼运动距离较对照组增加，兴奋性活动异常增高，而其余3组在光照期后第1 min黑暗期内运动距离均低于同期对照组，表明亚麻醉剂量和高于临床麻醉剂量氯胺酮暴露条件下幼鱼对光线的适应能力弱于对照组。值得注意的是，虽然各氯胺酮组幼鱼在光暗后表现趋势与对照组类同，但0.4 mg/mL氯胺酮组在光暗后第4 min运动距离才趋向光照前运动距离，而0.8、1.6 mg/mL氯胺酮组在光暗后第5 min运动距离仍高于光照前，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3（封二）。提示不同剂量氯胺酮暴露后，幼鱼在惊恐后的恢复过程存在差异，0.4～1.6 mg/mL氯胺酮暴露可能存在一定程度的兴奋效应或视网膜发育毒性作用，进而影响幼鱼的暗适应能力。

2.4 不同浓度氯胺酮暴露对成鱼学习记忆功能的影响 如图4A（封二），对照组斑马鱼经过训练后，与第1天相比，测试第5天进入EC区的潜伏时间显著缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）。各氯胺酮组斑马鱼测试第5天进入EC区的潜伏时间较对照组显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与测试第1天相比，各氯胺酮组潜伏时间不降反增（图4 A、B，封二）。对照组斑马鱼可在短时间内进入EC区吃食或寻找同伴，而各处理组中一部分斑马鱼表现为焦虑状态，即在T迷宫短臂或长臂徘徊而不进入EC区，或进入EC区后又立即出来，并不去寻找鱼群及食物，另一部分斑马鱼表现为抑郁状态，即在T迷宫内静止不动（图4 C、D，封二）。以上现象和结果提示氯胺酮呈剂量依赖性影响成年斑马鱼的学习记忆能力，同时可能对其情绪产生影响。

3 讨 论

氯胺酮可产生麻醉、镇痛、抑制恐惧和焦虑以及遗忘作用，广泛应用于产科和小儿外科麻醉中，其可能作用机制是通过非竞争性抑制NMDA受体，阻滞兴奋性神经递质的传递而发挥作用。有研究显示氯胺酮可以引起啮齿类[11-13]或灵长类动物[14]发育期脑内神经元的变性死亡，并对动物的认知和学习记忆能力产生持久性损害。体外人神经干细胞培养显示，氯胺酮可引起神经元凋亡[15]。但也有学者认为氯胺酮只有在作用时间足够长，作用浓度足够大时才会引起神经元结构和认知功能损害。

斑马鱼胚胎在24 hpf时原代神经元开始分化并出现心跳，到48 hpf时脑室形成，发育到6 dpf时所有神经系统形成，其形态发生在进化上高度保守，神经元的形成及分化等过程与其他脊椎动物相似[16]。由于斑马鱼血脑屏障在3 dpf才逐步完善[17]，胚胎时期神经系统对外来毒物更为敏感。FÉLIX等[10]将囊胚期（2~3 hpf）斑马鱼胚胎暴露于0.2，0.4，0.8 mg/mL氯胺酮20 min，发现氯胺酮呈剂量依赖性增加斑马鱼胚胎及幼鱼的畸形率和死亡率。本实验室前期研究在斑马鱼胚胎早期（4~18 hpf）暴露于不同浓度氯胺酮，发现氯胺酮对24 hpf斑马鱼胚胎产生剂量依赖的死亡率和畸形率。本实验结果显示，早期氯胺酮长时间多次暴露后，高于临床剂量的氯胺酮明显影响幼鱼的形态发育，其致畸效应呈剂量依赖性增加。KANUNGO等[18]将28 hpf斑马鱼胚胎暴露于0.55 mg/mL氯胺酮20 h后，尽管幼鱼外形发育无明显影响，但中枢神经系统运动神经元明显减少。

行为活动作为最敏感指标，是机体通过自身机能的调整消除或减少损伤的表观。行为学检测虽然相对较简单，但能从宏观上早期发现外源性物质引起的神经功能性障碍，比病理学检查更为直接、敏感。斑马鱼惊恐反应于68 hpf产生，此时斑马鱼的眼睛正在形成，视网膜神经元突触也正在建立。发育至96 hpf后，幼年斑马鱼具有自由运动的能力。因此，可通过对光照刺激引发的惊恐反应能力和刺激撤除后行为恢复能力的变化，检测由视觉引发的感觉运动高级神经回路是否正常[19]。本实验在6 dpf时于同一天对幼鱼进行自由运动和强光刺激诱发的惊恐逃避反射实验，结果显示氯胺酮暴露组幼鱼自由运动的速度和运动距离均较对照组增加，其运动轨迹增多、紊乱；在暗适应后给予强光刺激，处理组幼鱼表现出对光照后的适应能力减弱。尤其在高浓度氯胺酮组（0.8 mg/mL，1.6 mg/mL）幼鱼运动发生明显异常，其光照期运动距离较黑暗期不降反增，其原因是由于高浓度氯胺酮引起的神经毒性还是视网膜受损还需进一步探讨。

T迷宫实验是一个检测学习记忆能力的经典行为模型[20]。本实验待幼鱼发育至2个月后，进行成鱼T迷宫行为学检测，结果显示，各浓度氯胺酮处理组成年斑马鱼经过训练后并不能快速找到EC区，高于临床麻醉剂量的氯胺酮则使成年斑马鱼的学习记忆能力受到更严重的损伤，并可能对其情绪产生影响，表现为焦虑与抑郁并存，但造成这种学习记忆能力变化的具体机制还需要进一步探究。

综上所述，氯胺酮暴露浓度≥0.4 mg/mL时，胚胎期斑马鱼生长发育、自由运动及学习认知功能均受到不同程度的影响，这种神经毒性作用呈剂量依赖性，这为临床上安全应用氯胺酮进行孕产妇和婴幼儿麻醉提供有价值的参考。