非侵入性生物标志物微小RNA在感染性疾病中的研究进展*

谢可心，李福兴，张玉琳 综述，赵卫东 审校

大理大学临床医学院，云南大理 671000

微小RNA(miRNA)是一种小的内源性非编码单链RNA分子，长度为18～22个核苷酸，通过与特定的信使RNA(mRNA)3′非翻译区(3′UTR)结合，导致mRNA降解或翻译抑制，从而对基因进行转录后的表达调控[1]。研究表明，人类基因组中miRNA基因仅占人类基因组的3%左右，却可调节高达60%的蛋白质编码基因，并参与细胞凋亡、增殖、分化和转移等生物学过程[2]。

据研究，miRNA在心脏、肝脏和肾脏等器官损伤时会被释放出来，其相对表达水平的变化会引起心血管疾病、阿尔茨海默病、恶性肿瘤等疾病[3]。由于循环miRNA在体液中易获得，且具有稳定性高等优势，成为目前研究的重点。近年来，在感染性疾病中 miRNA的表达得到广泛的研究。当病原微生物感染宿主后，宿主会利用原发性或继发性免疫应答来清除和杀灭病原微生物，而病原微生物也会利用宿主基因组中的某些特定miRNA，改变miRNA的表达模式来改变自身生存环境，以利于病原微生物的生存、复制和传播，从而导致感染相关疾病的发生和发展。本文对miRNA在感染性疾病中的研究进展进行综述。

1 miRNA与细菌感染

1.1miRNA与脓毒症 miRNA已被证明是一种潜在的脓毒症生物标志物。研究发现，与健康对照者相比，脓毒症患者miR-223[4]、miR-155[5]等表达升高，而miR-10a[6]的表达降低。不同细菌感染时，miRNA的表达同样有差异。MA等[7]发现，miR-128过表达可以抑制金黄色葡萄球菌诱导的巨噬细胞炎性反应。与健康对照者相比，6个miRNA在铜绿假单胞菌感染患者外周血单个核细胞中的表达有显著差异[8]。此外，动物模型表明miRNA参与脓毒症的病理过程。在脂多糖诱导的小鼠模型中，miR-15a-5p可能通过激活核因子κB(NF-κB)途径，上调肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导蛋白3相互作用蛋白2(TNIP2)的表达，参与脓毒症的炎症过程[9]。因此，这些miRNA可作为生物标志物为脓毒症的诊断提供一个新思路，从而为脓毒症早期抗感染治疗提供依据。然而，尽管进行了多年的研究，仍然没有就脓毒症患者循环中miRNA临床应用分析的最佳标准化策略达成共识。这很可能是由于在脓毒症患者的不同队列中存在显著的miRNA调节模式的差异，缺乏标准化样本收集及数据规范化分析等。

1.2miRNA与结核 在结核分枝杆菌感染时，特定miRNA的表达会发生变化。ZHANG等[10]通过生物信息学分析证明，miR-892b、miR-199B-5p和miR-582-5p可作为活动性肺结核新的诊断标志物。此外，不同治疗阶段的结核病患者血清中miRNA的表达也不同，其中miR-21-5p可区分治愈和未经治疗的肺结核患者[11]。NIU等[12]通过建立细胞模型，发现miR-147b通过C11orf87轴介导的PI3K/AKT途径来调控巨噬细胞在体外的增殖和迁移。越来越多的证据表明miRNA是众多以不同方式参与结核分枝杆菌发病和宿主反应的遗传因子之一。通过降低或增加特定miRNA的表达，进而抑制或激活其控制的基因，可以预防结核病的进展甚至可以作为治疗靶点应用于临床。

1.3miRNA与幽门螺杆菌 很多miRNA被认为与幽门螺杆菌相关胃癌的发生、发展密切相关。与胃炎患者相比，胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤患者胃中miR-150、miR-155、miR-196A、miR-138的表达上调，miR-153、miR-7的表达下调，并在小鼠模型中得到验证[13]。在幽门螺杆菌感染导致胃癌的发病机制中，有研究发现宿主基因TRPM3启动子的异常甲基化，使胃癌患者的miR-204表达下调，在胃癌细胞模型中，miR-204抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路的激活，并在动物模型中抑制肿瘤的生长和转移[14]。幽门螺杆菌与多种miRNA在不典型增生、萎缩、消化性溃疡、肠化生、胃炎及其他胃肠道疾病中的分子机制需进一步研究，探讨幽门螺杆菌对胃癌和其他胃肠道疾病发生、发展过程中不同抑癌基因miRNA相对表达水平的变化，将为临床提供更多信息。

2 miRNA与病毒感染

2.1miRNA与病毒性肝炎 miRNA的异常表达与病毒性肝炎的发生密切相关。高通量测序研究表明，miR-522和miR-523在乙型肝炎病毒阳性的肝细胞癌患者中过表达，且与远期预后显著相关[15]。最新的研究表明，miR-224与慢性丙型肝炎的脂肪变性相关，同时miR-101可能通过下调PI3K/Akt/mTOR途径在慢性丙型肝炎中起抗纤维化作用[16]。肝炎病毒感染的过程和相关的肝损伤取决于多种因素，如病毒的遗传变异性，以及宿主与病毒的相互作用。如何利用miRNA调控肝炎病毒的表达，早期诊断和识别能预防其发展成致命的并发症，如肝硬化和肝癌，将成为改善预后、抗病毒和抗肿瘤治疗的新方式。

2.2miRNA与获得性免疫缺陷综合征(AIDS) miRNA参与AIDS的发生、发展过程。人类免疫缺陷病毒(HIV)据其亚种、传染性、毒性及其流行程度分为2组，HIV-1比HIV-2更具感染性和毒性。有报道称HIV-1感染人体的过程受miRNA的影响，通过直接作用于病毒基因组或编码复制病毒所需的宿主细胞蛋白来调节HIV-1的感染和复制[17]。近年来，人们发现miRNA及其表达在AIDS不同时期可能存在差异。如在AIDS病毒感染的急性期，miR-3162-3p在血浆中表达下调，在原始CD4 T细胞中，miR-124a、miR-29a和miR-223等表达上调，而促进病毒进入细胞的miR-125b表达下调[18]。虽然标准检测方法在检测低病毒载量等方面存在局限性，但监测miRNA可为诊断和预测AIDS进展提供有价值的信息。随着高灵敏度检测技术和高通量测序技术的发展，miRNA可作为一种成本较低的疾病诊断方法，有望为HIV感染者带来新的希望。

2.3miRNA与流感 miRNA在流感病毒的感染进程中起关键作用。微阵列分析H1N1甲型流感病毒(IVA)患者外周血中miRNA的表达谱发现，IVA患者外周血中miR-132-3p的表达上调，而miR-132-3p过表达会抑制IVA激活的干扰素α和IFN-β的产生，从而促进IVA的复制[19]。此外，miR-324-5p通过靶向H5N1的PB1病毒RNA来抑制H5N1的复制，通过靶向JAK1-STAT3途径负调控细胞的CUEDC2基因，增强Ⅰ型干扰素、Ⅲ型干扰素和干扰素诱导基因的表达，随后抑制H5N1病毒复制[20]。宿主miRNA直接或间接靶向病毒基因以调节感染期间的先天免疫反应和病毒复制。基于miRNA的特性，研究那些既能降解流感病毒RNA又能减轻病毒诱导炎性反应的miRNA，可以开发出新一代的流感疫苗。总之，特异miRNA是一种潜在的诊断标志物和临床治疗工具。

2.4miRNA与冠状病毒肺炎 miRNA参与冠状病毒的感染进程。在机体的固有免疫中，Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)起抗病毒作用。有研究发现，冠状病毒可通过miR-30a-5p/SOCS 轴来拮抗Ⅰ型干扰素的抗病毒作用[21]。LI等[22]研究发现，Gga-miR-30d过表达可抑制冠状病毒的复制。DICKEY等[23]在研究冠状病毒诱发的神经系统疾病的小鼠模型中发现，miR-155可增强T细胞运输及抗病毒的能力。降低宿主特异性miRNA的水平可能会促进病毒的复制，从而导致宿主免疫系统对病毒的免疫识别和清除。然而，由于对miRNA功能的干预可能导致免疫功能受损或其他不可预见的生物异常，需要谨慎对待。此外，在冠状病毒感染细胞内使用特异性的拮抗剂进一步沉默miRNA，可能成为miRNA参与疾病病原学的另一种治疗策略。

3 miRNA与真菌

miRNA在宿主与真菌的相互作用中起调节作用。研究发现，miR-146a通过编码白细胞介素1受体相关激酶1(IRAK1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)，负向调节NF-κB的活化，从而抑制炎性细胞因子的释放，故miR-146a可作为新型隐球菌感染的治疗手段[24]。在念珠菌感染的小鼠模型中，miR-146a、miR-155、miR-455和miR-125a表达上调[25]。由于真菌感染而引起的不同循环miRNA相对表达水平的变化，可以通过不同的技术在循环中进行定量或检测，这些技术将为miRNA作为真菌感染的潜在生物标志物。

4 miRNA与肺炎支原体

肺炎支原体肺炎(MPP)的发病机制可能与miRNA有关。实时荧光定量PCR检测36例MPP患儿外周血发现，miR-222-3p在MPP患儿血浆中相对表达水平明显高于健康对照者，使用肺炎支原体脂质相关膜蛋白(LAMP)刺激THP-1细胞和小鼠，发现LAMP刺激后，THP-1细胞的miR-222-3p相对表达水平呈剂量依赖性增加；同时，在LAMP刺激下小鼠的细支气管周围有大量炎症细胞浸润，支气管肺泡灌洗液中的miR-222-3p相对表达水平增加[26]。此外，LI等[27]研究发现，MPP患儿血清miR-29c相对表达水平明显低于健康对照者，而SB7-H3和白细胞介素17水平明显高于健康对照者，研究发现B7-H3是miR-29c的直接靶点，miR-29c的沉默或过表达可上调或下调THP-1细胞中B7-H3的表达。以上研究均表明，miRNA与MP感染密切相关，虽然目前的研究大都集中在对其表达差异的分析上，关于其在MPP中的作用机制研究较少，但这为以后进一步研究miRNA在MP感染中的作用机制奠定了基础，使miRNA成为诊断疾病新的、有潜力的生物标志物成为可能。

5 miRNA与沙眼衣原体

miRNA在沙眼衣原体感染中的作用成为近年来研究的热点。微阵列分析结果显示，miR-147b和miR-1285在炎性沙眼瘢痕形成中表达上调[28]。在生殖道感染小鼠模型中发现，感染后第6天miR-125b-5p、miR-16等表达显著下调，而miR-146和miR-451表达显著上调[29]。此外，发现再次感染后生殖道中miRNA表达谱不同，相对表达水平也增高。这些研究提示在衣原体感染过程中miRNA在调节抗衣原体保护性免疫中起着至关重要的作用，表明某些miRNA可能成为有意义的诊断性生物标志物，也可能为未来疫苗研制提供帮助。

6 miRNA与梅毒螺旋体

有研究证明miRNA在梅毒螺旋体感染过程中参与细胞的免疫反应。在综合分析中，鉴定出74个差异表达的miRNA，经实时荧光定量PCR证实，hsa-miR-195-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-3p在梅毒螺旋体血清学阳性和梅毒螺旋体治愈患者中有显著差异，其中hsa-miR-195-5p在未经治疗的梅毒螺旋体患者和健康对照者之间差异有统计学意义，首次证实梅毒螺旋体感染不同阶段外周血单个核细胞中miRNA的差异表达[30]。此外，梅毒螺旋体刺激的巨噬细胞来源的外泌体表达高水平的miR-146a-5p，并通过连接黏附分子来减少单核细胞通过内皮的迁移[31]。miRNA表达谱的改变可能通过调控靶基因或信号通路与免疫耐受，其与持续性梅毒感染相关，说明miRNA具有作为梅毒螺旋体感染的非侵入性生物标志物的巨大潜力，这将有助于更好地诊断和治疗梅毒螺旋体感染。

7 miRNA与立克次体

立克次体通过调节miRNA调控宿主基因的表达。微阵列方法分析感染3 h或24 h的人微血管内皮细胞miRNA的差异表达，其中miR-129-5p、miR-200a-3p、miR-297、miR-200b-3p和miR-595被鉴定为前5种上调的miRNA，miR-301b-3p、miR-548a-3p和miR-377-3p被鉴定为前3种下调的miRNA[32]。SAHNI等[33]研究发现，在立克次体感染的人微血管内皮细胞中miR-424和miR-503的表达显著下调，进而促进高水平的成纤维细胞生长因子受体1的表达，促进病原体的侵入及传播，随后在小鼠感染模型中得到证实。因此，特异性的miRNA可能参与宿主-病原体相互作用和病理生理学过程，为开发新的立克次体感染的诊断或治疗方法提供依据。

8 miRNA与寄生虫感染

8.1miRNA与疟疾 疟原虫能改变红细胞miRNA在血液中的表达。使用微阵列方法确定了5个上调的miRNA(miR-3135b、miR-6780b-5p、miR-1246、miR-6126和miR-3613-5p)可以作为成年输入性恶性疟疾预测、预后及严重程度的潜在血液生物标志物[34]。在小鼠模型中，比较未感染、严重但非脑型疟疾和脑型疟疾小鼠大脑中miRNA的表达发现，每组小鼠中miRNA的表达均不同。此外，有研究证明，某些miRNA参与了与脑型疟疾相关的转化生长因子-β信号通路及细胞内吞途径[35]。因此，这些miRNA可能代表宿主的免疫状态，作为成年输入性恶性疟疾诊断的强有力的非侵入性生物标志物及治疗靶点。但是，对miRNA在疟疾感染中的作用认识还不够。进一步的研究可能会有助于使用这些小分子来识别患有严重疟疾的患者，并促进治疗决策。

8.2miRNA与血吸虫病 miRNA与血吸虫病的发病机制密切相关。在感染日本血吸虫的患者和健康对照者的肝脏组织中发现，hsa-miR-150-5-p、hsa-miR10a-5p、hsa-miR-199-a-3-p等通过作用于代谢、细胞外基质蛋白、脂质动员和限制氧化损伤应激而在血吸虫肝纤维化中发挥重要作用[36]。在小鼠模型实验中发现，血吸虫来源的miRNA参与疾病的多种病理途径。如来自寄生虫的Sja-miR-1存在于感染小鼠肝星状细胞中，并通过靶向分泌的跨膜受体相关蛋白1上调胶原和α平滑肌肌动蛋白A的表达，促进小鼠血吸虫肝纤维化的发生[37]。这些研究提示miRNA可作为诊断血吸虫病肝脏病理的候选生物标志物和治疗血吸虫病相关肝纤维化新的治疗靶点。

9 总 结

综上所述，循环miRNA作为感染性疾病的新型生物标志物已经成为研究的焦点。这是由于循环miRNA表现出高度的稳定性，但在各种感染性疾病中的表达往往是异常的，并且可以被现有的分子生物学技术检测到。遗憾的是，在临床应用中仍存在许多障碍。首先，miRNA谱在一个特定的群体中并不完全相同，并且许多miRNA是个体依赖的。大部分在体外进行的研究证实了其作为生物标志物的潜力，然而，需要在体内和临床试验中进一步确认其结果。其次，缺乏分离和鉴定特异性miRNA的标准化方法。目前，检测循环miRNA的方法主要有高通量测序法、miRNA芯片法、Northern blot法、实时荧光定量PCR法。其中高通量测序法价格昂贵，难以在实验和临床中普及；Northern blot法步骤繁琐且需要大量的RNA输入，给miRNA的定量带来了困难；实时荧光定量PCR是研究miRNA最常用的方法，操作简便、快速，且具有较高的灵敏度和特异度，有助于循环miRNA的鉴定。然而，血浆或血清中的检测、离心参数、用于血液收集的抗凝血剂、RNA提取和扩增方法及患者分层的不同方法等几个变量的存在，决定了miRNA表达检测的可变性。这就需要对检测miRNA的方法学进行强有力的验证并加以标准化。同时需要建立规范的大数据分析和管理体系进行数据解释。此外，需要排除外部因素的干扰。如在实验过程中，需要采取额外的预防措施，以避免实验污染；miRNA的检测及鉴定应该由具有丰富分子生物学和生物信息学知识的有经验的研究人员来完成。尽管miRNA在感染性疾病的发病机制、诊断及治疗中的重要性越来越受到广大科研工作者和临床医生的关注，并且发现某些特异的miRNA越来越多地被用于诊断中，但其仍处在研究的初期阶段。为了提高感染性疾病诊断的准确性和高效性，仍需要更多的研究来明确这些生物标志物在感染性疾病中是如何发挥作用的，从而提高miRNA在诊断感染性疾病中的灵敏度和特异度，明确生物标志物对感染性疾病诊断及治疗的价值。尽管目前研究存在局限性，相信随着研究的不断深入，miRNA在感染性疾病的诊断、监测、治疗与预防中的地位将日益显著。