spo0A对艰难梭菌毒素A/B蛋白表达的调节作用

宋晓蕾，周芬芬，胥 腾，王 莉，李静文，黄海辉

艰难梭菌（Clostridioides difficile）是革兰阳性专性厌氧梭状芽孢杆菌，是医院获得性腹泻最主要的病原菌，其中25%～33%抗生素相关性腹泻和90%假膜性肠炎由艰难梭菌感染所致[1-2]。艰难梭菌主要通过产生毒素A和毒素B致病，部分菌株如核酸型027和078还可产生二元毒素[3-4]。毒素A和毒素B分别由tcdA和tcdB基因编码，二者位于一个长约19.6 kb的致病决定区（pathogenicity locus）上。该致病决定区除了tcdA和tcdB基因以外，还携带tcdE、tcdR和tcdC基因[4-5]，后者被认为与毒素的表达调控相关。

DNA结合蛋白Spo0A是细胞从营养生长期进入芽孢形成时期的关键应答调节蛋白。同时，Spo0A还控制着细菌的许多其他重要活动，例如对肉毒杆菌神经毒素的产生具有正向调控作用[6]。但是Spo0A对艰难梭菌毒素调控作用的研究较少，且结果不尽相同。因此，本研究构建了艰难梭菌spo0A基因突变株，通过比较突变株与亲代株间致病决定区上相关基因转录差异以及毒素A、毒素B表达差异，探索Spo0A对艰难梭菌毒素调控作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 构建艰难梭菌spo0A 突变株

选取艰难梭菌临床分离株C25用于spo0A基因敲除，该菌株为核糖体014型，产毒素A和毒素B。以标准菌株VPI 10463为对照株。采用ClosTron基因敲除技术在艰难梭菌spo0A基因中插入包含Ⅱ类内含子的序列，使该基因发生突变而失活[7]。

1.2 检测tcdA、tcdB、tcdC、tcdR、tcdE基因表达水平

在不同生长时期，即分别于5 h（指数生长期）、12 h（开始进入平台生长期）、24 h（平台生长期）、48 h时（平台生长末期）分别取（20 mL、10 mL、10 mL、10 mL）菌液离心浓缩后，按说明书裂解细菌、提取RNA、去除基因组DNA，合成cDNA，进行实时定量反转录PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）。其中裂解细菌试剂盒系中国杭州遂真生物科技有限公司产品，RNA保护剂和RNA提取试剂盒系德国QIAGEN公司产品，去除基因组DNA、合成cDNA以及RT-qPCR采用的试剂盒系日本TaKaRa公司产品。以编码核糖体蛋白的rspJ作为内参，检测tcdA、tcdB、tcdC、tcdR、tcdE基因mRNA的相对表达量。所用引物如表1所示[8-9]。

1.3 定量检测毒素A

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细菌上清液中毒素A的含量。取0.01 μg/L抗A毒素抗体100 μL，37℃ 孵育2 h预包被ELISA板，加入5%脱脂牛奶300 μL，再次37℃孵育60 min封闭ELISA板。分别于5、12、24、48 h时收集1 mL菌液，离心（3 000×g，10 min）取上清液加入PBS进行适当稀释后，每孔加入100 μL，37℃孵育60 min；然后加入100 μL新鲜稀释（1∶1000）的酶标抗体（江苏海元蛋白生物技术有限公司），室温孵育30 min；再加入100 μL等体积预混的显色剂A、显色剂B（阿拉丁，上海），室温避光显色10 min；最后每孔加终止液（1 mol/L H2SO4）100 μL，终止反应。使用UV-2102 C 型紫外可见分光光度计（尤尼柯，上海）测量各孔450 nm 波长的吸光度（D值），计算毒素A浓度值。标准曲线的绘制采用对倍系列稀释的标准毒素（List Biological Laboratories Inc，美国），浓度范围为0.781 25 ～ 100 μg/L。

表1 引物及序列Table 1 Primers used in this study

1.4 半定量检测毒素B

采用终点效价测定法对细菌上清液中的毒素B含量进行半定量，具体方法如下[10]：将Vero细胞（上海生命科学院细胞资源中心）以每孔1×104个细胞的浓度接种到96孔板上，在37℃、5% CO2条件下过夜培养。分别于第5、12、24、48 h取1 mL菌液离心（30 min，3 000×g，4℃），0.45 μm的醋酸纤维素膜过滤后，加入DMEM培养基（Sigma，美国）进行2、10、102、103、104、105倍的系列稀释。取50 μL各稀释液加入到单层Vero细胞中，在37℃、5% CO2条件下培养1 h。同时将各个时间点的2倍稀释上清液与1∶25稀释的抗毒素（Techlab，美国）在37℃、5% CO2条件下中和1 h，取50 μL中和液加入到单层Vero细胞中培养1 h作为对照。再将96孔板中的上清液移除，加入100 μL新鲜细胞培养液后培养24 h。倒置显微镜观察每个时间点从低至高稀释度的细胞形态变化。终点效价是指第一个出现单层Vero细胞形态和对照无差异的稀释度。

1.5 统计分析

所有实验均重复3次，结果采用平均值±标准差表述。所有数据分析使用SPSS 22.0软件完成。采用KS检验验证连续变量的正态分布，F检验验证组间方差齐性，并视其结果选择标准Student’st检验或原始数据经对数变换后的t检验，分析spo0A突变株与亲代株间毒素水平及相关基因转录水平差异是否有统计学意义。P＜0.05为组间差异具统计学意义。

2 结果

2.1 spo0A 基因对毒素A和毒素B数量的影响

随培养时间的延长，VPI 10463菌株、C25菌株、C25spo0A突变株培养液中毒素A含量呈逐渐增加趋势。在培养5 h（指数生长期），C25spo0A突变株即可以在细菌外检测到毒素A，而C25菌株培养液中毒素A含量低于检测下限。在培养12、24 h后，C25spo0A突变株培养液中毒素A含量均明显高于C25菌株，差异有统计学意义（P＜0.05，见图1A）。同时VPI 10463菌株、C25菌株、C25spo0A突变株培养液中毒素B含量随培养时间延长亦呈增加趋势。C25spo0A突变株在培养5、12、24 h后培养液中毒素B的含量均高于C25菌株，但差异无统计学意义，在培养后48 h毒素B含量与C25菌株相仿（见图1B）。

图1 毒素A和毒素B的表达量Figure 1 The expression levels of toxin A and toxin B

2.2 spo0A 基因对致病决定区基因表达量的影响

spo0A基因对艰难梭菌致病决定区上的毒素基因（tcdA、tcdB）及毒素调控基因（tcdE、tcdR、tcdC）表达量的影响见图2。从指数生长期进入平台生长期后，VPI 10463菌株、C25菌株、C25spo0A突变株tcdA、tcdB基因mRNA表达量均升高，进入平台期后，表达量趋于稳定。C25spo0A突变株在培养12、24、48 h后毒素基因表达量均高于C25菌株：tcdA基因分别为10.6倍、31.6倍、24.2倍；tcdB基因分别为4.2倍、32.1倍、15.4倍。tcdR、tcdE基因表达量与tcdA、tcdB基因表达量相一致，从指数生长期进入平台期后表达水平升高，而后表达量趋于稳定。C25spo0A突变株在培养12、24、48 h后，tcdR、tcdE基因表达量均高于C25菌株，在6～16倍。VPI 10463菌株可见从指数生长期进入平台期后tcdC基因表达量升高，进入平台生长期后，表达量趋于稳定，而C25spo0A突变株、C25菌株tcdC基因表达量无明显时间依赖性，且C25spo0A突变株与C25菌株在各个时间点的tcdC基因表达量差异均无统计学意义。见图2。

3 讨论

在许多产芽孢的病原体中已发现Spo0A不仅是芽孢形成的关键蛋白，且与毒力因子也密切相关。在艰难梭菌中亦有研究发现Spo0A可调控毒素A和毒素B的表达。Underwood等[11]发现630Δermspo0A突变株表达毒素A的量只有亲代株的10%不到，且Vero细胞细胞毒性降低至1/1 000。Mackin等[10]的研究结果却显示630Δermspo0A突变株细胞毒素A和毒素B含量均与亲代菌株差异无显著统计学意义；078spo0A突变株毒素B含量在12、24 h均高于亲代菌株，但48、72 h与亲代菌株相仿；027spo0A突变株毒素A和毒素B产量在各个检测时间点均明显高于亲代菌株，提示Spo0A对027菌株毒素A和毒素B的产生有抑制作用；而对630Δerm菌株和078菌株无明显作用。Deakin等[12]采用小鼠动物模型，发现小鼠感染630菌株和630spo0A突变株后均无明显疾病症状；感染027菌株的小鼠有明显的疾病症状，但这些症状在感染后5 d消失，小鼠均存活；但感染027spo0A突变株的小鼠症状较感染027的小鼠显著严重，且在感染后第5天 80%小鼠死亡。体外ELISA法检测结果显示指数生长中期毒素A和毒素B的含量均较低，在稳定生长期（30 h）时027spo0A突变株毒素A和毒素B的含量均显著高于亲代菌株，与动物实验结果一致，上述研究结果与Mackin等[10]相仿。本研究采用014型菌株，C25spo0A突变株在各检测时间点毒素A产量均显著高于C25菌株，同期突变株和亲代株tcdAmRNA表达水平亦与ELISA结果一致。C25spo0A突变株毒素B产量在培养后5、12、24 h亦均高于C25菌株，在培养后48 h毒素B产量两者相仿，RT-qPCR检测tcdBmRNA表达量亦与细胞毒中和试验结果基本相仿。本研究提示spo0A基因在014型菌株中可能对毒素A和毒素B的产生起负向调节作用，但本研究显示对毒素A的负向调节作用更为显著。

图2 毒素基因（tcdA、tcdB）及毒素调控基因（tcdE、tcdR、tcdC）mRNA表达量Figure 2 The mRNA expression levels of toxin genes (tcdA, tcdB) and toxin regulatory genes (tcdE, tcdR, tcdC)

艰难梭菌spo0A基因调控毒素A和毒素B表达的机制尚不明确。研究表明Spo0A在体外能够结合tcdB的上游序列[13]，然而并没有在致病决定区上游发现“OA-box”[11]。因此Spo0A可能通过间接调控的方式调节艰难梭菌毒素的表达[14]。基因tcdE、tcdR、tcdC与tcdA和tcdB均位于致病决定区。TcdR (22.1 kDa)为RNA聚合酶σ因子，可激活tcdA、tcdB及其本身转录。TcdE(18.8 kDa)因致病决定区上tcdE位于tcdB和tcdA较近的位置，且作为重组蛋白在大肠埃希菌中表达时有促进其裂解的作用，因此被认为在毒素A和毒素B的释放中有重要作用，但具体作用仍不明确。本研究发现tcdE、tcdR基因表达与毒素A和毒素B产生相一致，C25spo0A基因突变株在生长各阶段tcdE、tcdR基因的表达量均高于亲代株。提示Spo0A对tcdE、tcdR基因的表达起负向调控作用，且Spo0A可能通过抑制tcdE、tcdR的表达抑制毒素A和毒素B的产生。

本研究的局限在于仅敲除了核糖体014型菌株，且未进行体内研究。今后将增加实验菌株型别和数量以及动物实验等，进一步对spo0A在艰难梭菌毒素产生中的作用和机制研究。