CircRNAs在骨关节炎中的研究进展

欧阳靖，邝翠淋，戚泽涛，徐丛丛，吴龙火，李林福，张 蕊

（1.赣南医学院2020级硕士研究生；2.赣南医学院2018级制药工程专业本科生；3.赣南医学院2019级制药工程专业本科生；4.赣南医学院药学院，江西 赣州 341000）

环状RNA（Circular RNAs，circRNAs）是一类存在于真核生物的非编码RNA，与常见的典型线性RNA 不同，它们形成一个共价闭合的连续环，无5'和3'端，通常被认为是由于mRNA 剪接错误形成的副产品或者是转录本丰度低而形成的［1］。随着高通量测序技术和生物信息学方法的发展，在许多物种中都发现了大量circRNAs，人体细胞中也发现并鉴定了很多circRNAs，激发了基因组研究领域研究者的极大兴趣［2］。更重要的是，越来越多的证据表明circRNAs在细胞和组织中含量丰富，进化保守，相对稳定。研究发现circRNAs功能很多，可以作为“miRNA海绵”（“microRNA sponge”），如circRNA-5692 可以通过结合miR-328-5p 增强DAB2IP 表达，从而抑制肝癌的进展［3］；CircRNA cRAPGEF5通过miR-27a-3p/TXNIP 途径抑制肾细胞癌的生长和转移［4］；与RNA结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）相互作用［5-6］，调节基因转录［7］和蛋白质翻译［8］。

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是最常见的肌肉骨骼疾病之一，主要是由骨关节的退行性改变导致的，可导致关节功能衰退及患者生活质量的下降［9］。临床表现为关节疼痛如压痛、触痛，僵硬、关节活动受限、关节肿大或畸形、骨摩擦音、肌肉萎缩偶伴有积液和不同程度的局部炎症。骨关节炎的疼痛往往与活动有关，持续的疼痛是这类疾病的主要特征；其病理特征表现为关节软骨变性坏死，滑膜炎性病变，骨赘形成［10］。该病病程比较长且缓慢，早期会出现轻微的关节酸胀，症状较轻，经常被患者忽略，随着病程的加重，疼痛感会加重，且关节活动受限，炎症加重，发生粘连［10-11］。OA是老年人中最常见的慢性退行性关节疾病，很多研究都表明circRNAs在OA软骨中存在着差异表达的现象，一些circRNAs也参与了OA 的多种病理过程，如细胞外基质降解、炎症和细胞凋亡［12］。虽然circRNAs 的研究尚处于初始阶段，尤其是circRNAs 在OA 方面的研究也是鲜有可见，但它们在OA 的发生和发展中起到的作用不可忽视。因此，本综述简要概述circRNAs 的生物合成、特征和生物功能，并总结目前circRNAs 在OA发生发展中以及治疗方面的作用和病理意义。

1 CircRNAs的生物学特性

环状RNA（circRNAs）是一种非编码RNA（ncRNAs），参与转录和转录后基因表达调控［13］。第一个被发现的circRNA 是在1976 年SANGER HL 等证明一些植物类病毒是由单链共价封闭RNA 组成的分子组成［14］。之后，观察到丁型肝炎病毒HDV 具有环状RNA 基因组［15］，在1991 年首次在人类细胞中发现DCC能转录成circRNA［16］。

1.1 CircRNAs 的分类及特点CircRNAs 是一类没有5′帽子和3′poly（A）尾巴的环状RNA，主要位于细胞质或贮存在外泌体中，真核细胞中有广泛的表达。由于没有5′帽子结构和3′poly（A）尾巴，CircRNAs在体内相对比较稳定，不易受RNA核糖外切酶的降解［17］。CircRNAs 具有时序特异性、疾病特异性、组织特异性及高稳定性等特征，现发现多数circRNAs是由外显子环化而形成，也有部分circRNAs是内含子环化而成，根据来源，circRNA大致分可为3类：全外显子型circRNAs（exonic circRNAs），全内含子型circRNAs（intronic circRNAs），内含子-外显子组合的circRNAs（exon-intron circRNAs）。

1.2 CircRNAs 的合成机制CircRNAs 的合成方式分为外显子环化和内含子环化，目前主要的合成机制可分为以下4种，如图1所示。

1.2.1 套索驱动的剪切体环化形成circRNAs在pre-mRNA 上，下游3′-位点在连续的组装小核核糖体蛋白催化下直接连接到上游5′-位点，索尾插接形成套索环化，之后通过剪切形成无内含子的circRNAs［18］。

1.2.2 内含子配对驱动的环化形成circRNAs部分circRNAs 外显子两侧的内含子中含有反向互补序列，首先在剪切位点上并排形成RNA 双链体，再通过可变剪切形成带内含子和不带内含子两种不同的circRNAs［19］。或者外显子内部以及两侧的内含子可以竞争进行RNA 配对，最终通过可变剪切形成不同类型的circRNAs［20］。

1.2.3 RBP 或一类反式因子驱动的环化形成circRNAs通过将RBPs 结合到外显子侧翼的内含子上，从而促进circRNA的形成［18，21］。

1.2.4 内含子自身环化形成circRNAs在某些条件下，全内含子型circRNAs 可以直接由前体mRNA片段中的内含子环化而形成，全内含子型circRNAs主要存在与细胞核，并且所含与miRNAs 结合的位点比较少［22］。内含子直接成环的过程依赖于一个共用模序，这个共用模序包含一个5'剪接位点附近的7 nt的富含GU序列以及一个分叉位点附近的7 nt的富含C序列［7］。

1.3 CircRNAs 的功能CircRNAs 主要存在于细胞质和外泌体中，大量研究表明circRNAs 与生物体的生长发育、免疫应答、疾病发生发展等方面密切相关，且其在疾病诊断生物标记物等方面有很大的应用前景，但生物学功能很大程度上仍然未知。目前已发现的circRNAs生物学功能总结如下：

图1 CircRNAs的成环机制

1.3.1 细胞质中“miRNAs海绵”的作用CircRNAs链上富含有miRNAs 的结合位点，这些结合位点可以起到miRNAs海绵的作用，使miRNAs的3′非翻译区与circRNAs 结合，阻止其与靶mRNA 的相互作用，进一步调控miRNA下游靶基因的表达［23］。在人和小鼠的大脑中，circRNA Cdr1as 可以同时与miR-7、miR-671 相结合发挥作用，当Cdr1as 位点从小鼠基因组中移除时，表现出感觉运动通路受损——一种过滤掉不必要信息的能力缺失，这与miR-7和miR-671被激活有关［24］。

1.3.2 调控蛋白结合的作用CircRNAs 可以通过与调节mRNA 的结合蛋白（RBP）结合，进而改变mRNA 的剪接模式或影响mRNA 稳定性［5］。目前CLIP-seq 实验的兴起使得circRNA-RBP 相互作用的大规模识别和分析成为可能［25］。DU WW 的研究中使用了circ-Foxo3 探针，先使其被生物素化，然后链霉亲和素磁珠被添加到每个结合反应中，进一步孵育使链霉亲和素珠结合到生物素化的circ-Foxo3 探针上。生物素化的探针将拉下circ-Foxo3 以及与之结合的蛋白质。然后，磁珠被洗干净，与circRNA 结合的蛋白质可通过Western blotting 或质谱分析法分析与circRNAs 结合蛋白有哪些，并研究它们与疾病发生的关系［26］。

1.3.3 调控基因转录的作用CircRNAs 可与RNA聚合酶相互作用并调控其转录，剪接因子muscleblind（MBL/MBNL1）的第二个外显子在果蝇和人类中循环，circRNA（circMbl）及其侧内含子包含保守的肌盲结合位点，这些位点被MBL 特异性强结合。MBL 水平的调节强烈影响circMbl 的生物合成，这种影响依赖于MBL 的结合位点，数据表明circRNAs 可以通过与线性剪接竞争来发挥基因调控的作用，此外，还确定肌肉盲是circRNA 生物发生的一个因素［27］。

1.3.4 翻译表达有效蛋白的作用虽然circRNAs是非编码RNA，但也有少部分circRNAs 可被核糖体翻译并编码成多肽，进而行使调控功能。N6-甲基腺苷（m6A）是RNA 中最丰富的碱基修饰，可促进人类细胞中circRNAs 蛋白翻译的有效起始。有研究发现m6A基序在circRNAs中富集，单个m6A位点足以驱动翻译起始，这种m6A 驱动的翻译需要启动因子eIF4G2 和m6A 翻译子YTHDF3，并且能被甲基转移酶METTL3/14 增强，被去甲基化酶FTO 抑制，并在热休克时上调，通过多聚体谱分析、计算预测和质谱分析的进一步分析显示，m6A 驱动的circRNAs翻译非常普遍，有数百个内源性circRNAs 具有翻译潜力［28］。

2 CircRNAs在OA中的差异表达

随着基因芯片高通量筛选技术的快速发展，近年来越来越多的研究表明，与正常软骨相比，骨关节炎患者的软骨中circRNAs的表达量出现异常。对于基因芯片得到的差异表达circRNAs也许是个体差异导致，但是，芯片数据结果也可以作为研究OA 中circRNAs 的一个切入点，进而探索特定circRNAs 在OA 中所发挥的作用。YING WANG 等［29］的研究发现与正常关节相比，在OA 软骨细胞中有1 380 个circRNAs差异表达，筛选标准为FC≥2，P≤0.05，其中包括215个上调的circRNAs和1 165个下调的circRNAs，利用GO 分析和KEGG 信号通路分析分别对筛选得到的circRNA 基因进行功能注释，发现hsa_cir‑cRNA_0032131 在OA 中是有研究价值的circRNA。虽然该研究发现在OA 软骨细胞中存在一些表达差异的circRNAs 可能与OA 的病理过程有关，筛选出来的hsa_circRNA_0032131 极有可能参与了OA 的发生和进展，但是并没有相关的实验数据验证该观点［29］。KE XIAO等［30］利用测序平台检测OA膝关节髁突中circRNAs 的表达，共鉴定了197 个差异表达的circRNAs，如 hg38_circ_0007474 和 hg38_circ_0000118，并预测了21 个目标miRNAs，2 466 个基因和166 394 对circRNA-miRNA-mRNA。进一步分析了OA 相 关 的3 个circRNAs：hsa_circ_0045714、hsa_circ_0002485、hsa_circ_0005567。SHUAI XIANG等［31］通过综合生物信息学分析，研究了circRNAs 在OA 滑膜中的表达谱。共收集35 份滑膜样本，其中17 份来自膝骨关节炎患者，18份来自对照组，对5个OA滑膜样本和5个对照进行circRNAs测序，qRT-PCR检测发现6 个差异表达的circRNAs。进一步使用DAVID 数据库对差异表达的circRNAs 进行了GO 和KEGG 的富集分析，以注释其功能，并创建circRNA-miRNA 共表达网络，以估计在OA 滑膜中特异性表达的circRNAs 可能的分子调控机制，此外，通过RNA 测序，他们还发现122 个circRNAs 在OA滑膜中存在差异表达，通过qRT-PCR 证实了5个下调的circRNA 和1 个上调的circRNA 的表达［30］。从以往的研究可以发现OA 患者circRNAs 的表达量出现差异表达是一个非常重要的生理变化，该变化与OA 软骨细胞细胞外基质的降解，软骨细胞的增殖、凋亡和自噬有着密切的联系，对差异表达的circRNAs 进行进一步的研究有助于阐明骨关节炎的发生发展机制。

3 CircRNAs在骨关节炎发生发展中的作用

3.1 CircRNAs 与OA 软骨细胞EMC 的降解细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）和软骨细胞共同组成关节软骨，其中ECM 包含有许多成分，如蛋白聚糖、Ⅱ型胶原等蛋白多糖及另外一些非胶原蛋白、其他胶原亚型，软骨细胞是ECM 合成和储存运输的细胞，这些细胞的位置在陷窝处并具有不活跃的有丝分裂活动［32］。SHU YING SHEN 等［33］发现OA软骨组织中CircSERPINE2 表达降低与ECM 的过度消亡及合成代谢和分解代谢因子失衡直接相关，CircSERPINE2可作为miR-1271-5p的“海绵”，通过靶向miR-1271-5p和ERG 在人软骨细胞（HCs）中发挥作用。关节内注射腺相关病毒circserpine2-wt 可减轻兔模型中的OA。另一个机械应力相关circRNAs（circRNAs-MSR）在软骨中的作用研究，首先用生物信息学方法来预测circRNAs 和miRNAs在软骨中的相互作用，在体外进行circRNAs-MSR 功能缺失实验。发现共有104 个表达差异的circRNAs，在这些circRNAs 中，分别有44 和60 个circRNAs 表达上调和下调，软骨细胞在机械应激下circRNA-MSR 表达增加［20］。CircPDE4D 是一种来源于人线性PDE4D的环状RNA，在OA 进展过程中对维持ECM 起重要作用，在OA 软骨组织和炎症细胞因子刺激下，circPDE4D 显著下调，而circPDE4D 的敲除可导致Aggrecan 的丢失和基质分解代谢酶（包括MMP3、MMP13、ADAMTS4 和ADAMTS5）的上调，但与增殖或凋亡无关，另外在内侧半月板（DMM）失稳的小鼠模型中，circPDE4D 关节内注射减轻了DMM 诱导的软骨损伤［34］。OA 软骨组织中CircCDH13 的上调可显著诱导软骨细胞凋亡，促进细胞外基质分解代谢，抑制细胞外基质合成代谢［35］。

3.2 CircRNAs 作为“miRNA 海绵”在骨关节炎中的作用YING ZHANG 等［36］的研究发现在体内外OA 中circRNA MALAT1 上调，而miR-150-5p 下调，miR-150-5p 水平与MALAT1、AKT3 水平呈负相关，更重要的是，过表达MALAT1 可以通过负向调控miR-150-5p促进AKT3的表达。另一方面miR-150-5p的过表达可抑制细胞外基质降解，miR-150-5p 的缺失补救了MALAT1 下调或对IL-1 刺激软骨细胞导致AKT3 减少的现象，也就是说MALAT1 能作为miR-150-5p 的“海 绵”通 过MALAT1/miR-150-5p/AKT3 轴 调 控 细 胞 增 殖、凋 亡［36］。有 研 究 发 现CircCDK14 在关节磨损位置下调，同时调节了软骨的代谢，抑制了细胞凋亡，促进了软骨的增殖，在机制上，CircCDK14 的保护作用是通过miR-125a-5p 介导的，CircCDK14 通过miR-125a-5p“海绵”下调了Smad2 的表达，导致TGF-β信号通路功能障碍，在兔模型中，关节内注射腺相关病毒-CircCDK14也可以缓解OA，研究揭示了CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2轴在OA进展中的发挥了重要作用［37］。CircPDE4D被发现可作为miR-103a-3p的“海绵”而发挥作用，从而调控FGF18 的表 达，而FGF18 是miR-103a-3p 的直接 靶点［34］。在正常和OA 软骨组织中，转录因子LEF1 的差异表达增加了circRNA、circRNF121的表达，LEF1和circRNF121 的表达与Mankin 的评分呈正相关，circRNF121 的改变可介导细胞外机制（ECM）的降解、细胞凋亡和软骨细胞的增殖，miR-665 被确定为circRNF121 和MYD88 的直接调控靶点，circRNF121和MYD88 调节了软骨细胞的ECM 降解、凋亡和增殖，而这可以被miR-665 逆转，这表明LEF1 通过调控circRNF121/miR-665/MYD88轴影响NF-кB通路从而 影 响OA 的 进 程［38］。 生 物 信 息 学 预 测 了circCDH13 与miR-296-3p、miR-296-3p 与磷酸酶和tensin 同源物（PTEN）之间的调控关系，并通过RNA下调和荧光素酶检测验证，腺相关病毒也被用来揭示circCDH13 在中半月板（DMM）诱导的OA 小鼠失稳中的作用和机制，circCDH13 作为miR-296-3p 的“海绵”，调控miR-296-3p-PETN 通路，参与OA 的发生，体内沉默circCDH13 可明显减轻dmm 诱导的小鼠OA 的发生［35］。越来越多研究证明circRNAs 在骨关节炎中作为“miRNA 海绵”发挥着极其重要的作用。

3.3 CircRNAs 与OA 软骨细胞的增殖、凋亡和自噬有研究发现在体内外OA中circRNA MALAT1和AKT3上调，circRNA MALAT1的敲低可抑制IL-1诱导的软骨细胞增殖，促进细胞凋亡，增加MMP-13、ADAMTS-5 表达，减少胶原蛋白Ⅱ、aggracan 表达，MALAT1 上调或AKT3 过表达可增强细胞增殖，抑制细胞凋亡［36］。circRNA.33186 在IL-1β 蛋白处理的软骨细胞和不稳定的内侧半月板诱导的OA 小鼠模型的软骨组织中显著上调，circRNA.33186的沉默表达可以增加合成代谢因子（Ⅱ型胶原）的表达，降低分解代谢因子（MMP-13）的表达，还能促进IL-1β细胞转染后的软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡［39］。有研究显示circ_0136474 和MMP-13 在OA 软骨组织中的表达水平明显高于正常软骨组织，circ_0136474在OA 中通过促进MMP-13 表达和抑制miR-127-5p表达，抑制细胞增殖，过表达miR-127-5p 负向调控MMP-13 表达，促进细胞增殖，这表明在OA 中，circ_0136474 和MMP-13 通过竞争性结合miR-127-5p，抑制细胞增殖，同时增强细胞凋亡［40］。Hsa_circ_0045714 过表达可以抑制miR-193b 转录活性，从而上调IGF1R的表达，hsa_circ_0045714能促进Ⅱ型胶原和aggrecan 的表达，促进软骨细胞增殖，IGF1R 具有类似的功能，而miR-193b 可以抑制Ⅱ型胶原和aggrecan 的表达，抑制软骨细胞增殖但促进其凋亡，过表达IGF1R可以逆转miR-193b的作用，而miR-193b mimic或IGF1R siRNA可以抑制hsa_circ_0045714的功能，因此，hsa_circ_0045714可以通过促进miR-193b靶基因IGF1R 的表达来调节细胞外基质的合成以及软骨细胞的增殖和凋亡［23］。hsa_circ_0005567基因敲低加速了IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，而过表达hsa_circ_0005567 减缓了IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡，但这种作用可被3-甲基ladenine（自噬抑制剂）消除，表明hsa_circ_0005567 过表达通过诱导自噬抑制了软骨细胞凋亡，此外，hsa_circ_0005567 可与miR-495 竞争结合，降低了早期自噬标志物ATG14的表达，而ATG14 是miR-495 的直接靶标，miR-495 mimic 和ATG14 敲除均抵消了过表达IL-1 诱导的软骨细胞中hsa_circ_0005567促自噬和抗凋亡的作用，这些都说明hsa_circ_0005567通过调控miR-495/ATG14轴激活自噬，从而抑制IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡［41］。还有报道称ciRS-7（ciRS-7）/microRNA 7（miR-7）轴在OA 中异常表达，调节IL-1β 刺激的软骨细胞的增殖、炎症反应和凋亡［42］。

3.4 CircRNAs与OA 软骨细胞的炎症反应炎症的发生可以促进细胞软骨的降解，加重骨关节炎患者的病情，传统的炎症因子主要有肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、转化生长因子-β（TGF-β）等，许多研究发现circRNAs 调控骨关节炎进程与这些因子密切相关。如敲低circRNA-MSR 可抑制TNF-α 的表达，影响OA 的进程［20］。在OA 患者和IL-1β 蛋白处理的软骨细胞中circSERPINE2 表 达 降 低，TGFBR2 是miR-495 的 靶点，在OA 患者和IL-1β 诱导的软骨细胞中低表达，circSERPINE2 可以通过与miR-495 结合调控TGFBR2的表达［43］，从而削弱IL-1β 引起的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解。

3.5 其他近年来，有研究人员探究了人类的MSC（BMMSC）分泌的细胞外囊泡（Extracellular vesicle，EV）在人OA 软骨修复中的 作 用［44］。而ELENA DELLA BELLA 等［45］鉴定了人骨髓间充质干细胞（MSCs）成骨和软骨分化中miRNAs，piRNAs 和circRNAs 的差异表达，确定了一组差异表达的circRNAs 以及它们的亲本基因，其中涉及一系列的分子调控途径，如环核苷酸的调节用于成骨分化和胶原合成，FGF、TGF-β 通路中的信号转导，证明了BSCL2 在成骨分化中与circRNAs 的调控作用十分重要，该研究还发现circRNA FKBP5 在成骨和软骨分化中都是上调表达的，并且与地塞米松密切相关，circRNA FKBP5有可能参与了反激活途径。

4 CircRNAs 作为骨关节炎诊断和预后的生物标志物及在骨关节炎中的治疗作用

生物标记物的检测可以为诊断骨关节炎的软骨退化提供有用的信息，它反映了与疾病相关的分子的生物活性并可预测疾病进展的过程。不同的circRNAs 可以特异性地与miRNA 结合，该类复合物可以与转录因子一起调控基因的表达并维持生物体的体内平衡，在分子和细胞水平研究circRNAs 基因在病理组织和正常组织中的差异表达并进一步寻找重建平衡的机制。在分子和细胞水平研究circRNAs作用机制的文献首先是检测circRNAs 基因的生理模式中的功能障碍在各种组织中表达，并进一步寻找重建平衡的机制。在此背景下，circRNAs 作为几种疾病的新的潜在生物标记物，已有学者证明并建议使用circRNAs作为OA的生物标志物［22］。

CircRNAs参与多种疾病的发生发展，但circRNAs在OA 中的作用研究至今还比较少。QIANG LIU 的研究认为与ECM 相关的circRNAs（circRNA-CER）可作为治疗OA 的靶点［46］。在体外进行了circRNAs的功能缺失和恢复实验，与正常软骨相比共有71个circRNAs在OA差异表达，circRNA-CER的表达随着软骨细胞中IL-1和TNF水平升高而升高，用小干扰RNA对circRNAs进行沉默可抑制MMP13的表达，增加ECM的形成，研究还发现circRNA-CER 可能与MMP13竞争miR-136 而发挥功能，这表明circRNA-CER 可以通过调控MMP13 发挥内源性竞争性RNA（ceRNA）的功能，参与软骨细胞ECM 的降解［46］，也就是说circRNA-CER有可能作为生物标志物用于治疗OA。

5 总结与展望

近年来OA 等慢性疾病的发病率呈逐年上升的趋势，OA 是一种给患者带来巨大痛苦的关节疾病，给世界医疗资源带来巨大负担。尽管目前对于OA 的研究越来越多，各种OA 治疗方法层出不穷也呈现多样化，但治愈OA，减轻患者的不良感受还需要做很大的努力。近年来发现调节性非编码RNA，尤其是circRNAs 在OA 的发生和进展中发挥着重要作用。已有许多研究证实circRNA 参与了OA 密切相关的软骨细胞EMC 的降解、OA 软骨细胞的增殖、凋亡和自噬、OA 软骨细胞的炎症反应等，这说明circRNAs 有可能作为诊断和治疗OA 的新靶点，有望研发出新的治疗举措，当然，circRNA 的研究尚不成熟，目前主要集中研究的是OA 软骨细胞EMC 的降解和炎症反应，其他方面如软骨细胞的凋亡、自噬也值得继续深入研究。