淫羊藿中抗骨关节炎成分的分子对接研究

郭小华，朱燕亮，吴龙火

（1.赣南医学院药学院，江西 赣州 341000；2.上犹县中医院药剂科，江西 上犹 341200）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是世界上最常见的关节疾病，主要临床症状包括慢性疼痛、关节不稳定、僵硬、关节畸形和关节间隙狭窄等。现代研究提出了几个与OA 相关的致病因素，包括遗传、衰老、肥胖和关节失调等，但OA 的发病机制尚不清楚。OA 的发病率正在逐年上升，致残率也在不断攀升，且发病率与年龄有关［1-2］。OA 已经给家庭和社会带来了沉重的负担，为此国内外学者对骨关节炎的治疗进行了大量的研究，但由于骨关节炎的靶点众多，靶点网络复杂，故对其治疗基本停留在对症治疗，缓解疾病症状上，对骨关节炎的发病机制还在不断探索当中［3-4］。中药因为成分复杂，作用多靶点较多，用于治疗靶点复杂的骨关节炎已经成为一种共识。

淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物，味辛甘，性温，归肝经、肾经。在我国主要分布于陕西、山西、甘肃、青海、四川、宁夏等省，有40多个品种，但中国药典仅收录了5 种［5-6］。作为一味传统补益中药，淫羊藿最早记载于《神农本草经》，有强筋骨，补肾阳及祛风化湿的功效［7］。不同品种、不同产地、不同采收部位和不同采收时间的淫羊藿，其有效成分也有差异。目前研究发现，淫羊藿中共有200 余种化学成分，主要为黄酮、木质素和生物碱等类别化合物［8］。

传统中医药理论认为，淫羊藿能够祛风湿除痹痛，现代中药药理学研究表明，淫羊藿对骨质疏松、股骨头坏死有预防和治疗作用，同时对骨关节炎有积极的治疗作用［9］。淫羊藿苷是淫羊藿中研究较多的一种有效成分，被认为能够提高骨髓细胞活性，同时参与免疫调节和炎症抑制通路，对多种炎症因子或炎症靶点有抑制作用，从而保护软骨，治疗骨关节炎［10］。

淫羊藿的化学成分较多，且与骨关节炎相关的作用靶点也较复杂，因此从分子水平上探讨淫羊藿治疗骨关节炎的作用机制难度不小。章晓云等［11］利用网络药理学方法对淫羊藿中抗骨关节炎主要成分，以及抗骨关节炎主要成分的主要作用靶点进行了筛选，从淫羊藿中获得广玉兰内酯等21个潜在的抗骨关节炎成分，筛选出JUN、AKT1、RELA、MAPK1、IL6、CXCL8、MAPK8、MAPK14、FOS 及IL1B等10 个潜在的核心作用靶点。这些潜在核心靶点分布于NF-κB 信号通路、白细胞介素受体信号通路、T 细胞受体信号通路及破骨细胞分化通路等不同的信号通路［12-13］。由此可见，淫羊藿抗骨关节炎作用呈现出多成分、多途径、多靶点等作用特点。

然而，通过网络药理筛选出的抗骨关节炎活性成分对各潜在核心靶点是否有选择性，活性成分与核心靶点的相互作用方式及作用强弱如何尚不清楚。为此，本文旨在通过分子对接的方法，模拟网络药理筛选出的淫羊藿中21 个潜在的抗骨关节炎活性成分与6 个潜在的抗骨关节炎潜在核心靶点（选取各信号通路的代表靶点）的相互作用，从分子水平上探讨活性成分抗骨关节炎虚拟活性的强弱，及其对各靶点的选择性和可能的作用机制，为今后对这类化合物的结构修饰和进一步的药理实验提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料实验所需硬件是一台电子计算机，所需软件、在线程序及其用途见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 分子对接计算前处理

1.2.1.1 配体化合物的选取及对接前处理本研究选取淫羊藿中广玉兰内酯等21 个潜在的抗骨关节炎成分（化合物1～21，图1）作为分子对接的配体分子，以6 个潜在的抗骨关节炎核心靶点中的原始配体为阳性对照，比较21 个配体化合物、各原始配体与相应靶蛋白的对接数据。

表1 对接实验使用的软件、在线程序及用途

图1 淫羊藿中潜在的21个抗骨关节炎成分的化学结构

将21 个活性成分的平面结构在线转化成三维结构，并在Chimera 程序中将其置于对接靶蛋白的活性位点处，保存为pdb 格式文件。再将此pdb 格式文件的配体分子置于AutoDockTools（ADT）软件中加上电荷和非极性氢，保存为pdbqt格式文件。

1.2.1.2 受体分子的选取及对接前处理从Brookheaven 蛋白数据库中获取6 个核心靶点蛋白的晶体结构，在Chimera 程序中将蛋白晶体结构中的水分子、原始配体等剔除，保存为pdb 格式文件。再将此pdb格式文件的受体分子置于ADT软件中加上电荷和非极性氢，保存为pdbqt格式文件。

1.2.2 分子对接实验运算在ADT 软件中，设置pdbqt格式文件的配体分子和受体分子的网格，并运行AutoGrid 生成必要的图像文件，最后运行AutoDock进行分子对接计算实验运算。

以估计抑制常数（inhibit constant，Ki）和结合自由能（binding energy，△Gbind）为参考指标，以各靶点的原始配体为阳性对照，获取各活性成分与各靶蛋白对接的Ki 值和△G 值，并从最佳构象上分析各对接化合物与靶蛋白的结合模式，从分子水平探讨它们的结合模式和相互作用。

2 结 果

2.1 分子对接结果淫羊藿中21个抗骨关节炎成分与潜在的6个抗骨关节炎靶点对接的Ki值和△Gbind值见表2。

通过分子对接运算，从21个对接化合物与相应靶蛋白的分子对接数据上看，大部分对接化合物与RELA 蛋白对接的Ki 值都达到了纳摩尔水平，其中化合物4 对接的Ki 值最小，为6.84 nmol·L-1；化合物4、化合物6 及化合物13 对接的Ki 值整体上要小于其他化合物，其中化合物4 与FOS 蛋白和RELA 蛋白的Ki值分别为13.23 nmol·L-1和6.84 nmol·L-1，明显小于各自原始配体对接的Ki值。

表2 配体化合物与各靶点的对接数据

3 讨 论

3.1 分子对接数据分析从21 个对接化合物与6个靶蛋白的对接数据上看，化合物与RELA 蛋白对接的Ki值基本达到纳摩尔级水平，要小于与其他几个靶蛋白的对接数据，对接数据最优的是化合物4，Ki 值为6.84 nmol·L-1，我们推测淫羊藿中抗骨关节炎成分发挥抗炎作用主要是与RELA 蛋白结合，对RELA蛋白的选择性高于其他几个蛋白。

比较21个对接化合物的对接数据可以发现，化合物4、化合物6 及化合物13 的对接数据整体上优于其他化合物，和各靶蛋白对接的Ki值基本小于其他化合物，其中化合物4 与FOS 蛋白和RELA 蛋白的Ki值分别为13.23 nmol·L-1和6.84 nmol·L-1，也明显小于各自原始配体对接的Ki 值。表现出与潜在核心蛋白很强的结合能力，虚拟抑制活性较强。由此我们推断，淫羊藿中发挥抗骨关节炎作用的主要成分可能为化合物4、化合物6及化合物13。

对接数据最不理想的是化合物11，从构象上看应该是长直链化合物11 空间上不匹配各靶蛋白的活性位点，与靶蛋白结合不牢固，结合构象不稳定。

综上所述，我们初步推测淫羊藿中21个潜在抗骨关节炎成分发挥抗炎作用的主要为化合物4、化合物6 及化合物13；各化合物与RELA 蛋白的对接数据最优，表现出对该核心靶点较高的选择性，可能是淫羊藿抗炎作用的最重要的靶点。

为更直观体现化合物与靶蛋白的结合作用，我们选取RELA 蛋白为代表靶点，从分子对接构象上探讨分析对接数据较好的化合物4和对接数据较差的化合物11与RELA蛋白的结合方式和相互作用。

3.2 分子对接构象分析

3.2.1 化合物4 与RELA 蛋白对接构象分析RELA 蛋白是NF-κB 信号通路中的一个关键蛋白，对骨关节炎的发生发展起着重要的作用，晶体结构衍射实验显示，RELA 蛋白的活性位点主要由三个活性口袋，分别是A口袋、B口袋和C口袋（图2）。A口袋由VAL300、HIS252、LEU153、PHE299等氨基酸构成，而LEU253、GLU154、GLY298等氨基酸则构成了B 口袋，C 口袋则由ILE249、ASN251 及ALA73 等氨基酸构成。

图2 化合物4与RELA蛋白对接最佳构象图

分子对接实验时，化合物4能够完全占据RELA蛋白中的三个活性口袋（图2），化合物4中的黄酮母核结构占据了A 口袋，母核上的两个羟基分别与VAL300和HIS252两个氨基酸形成了两个氢键相互作用力；化合物4 中氧萘母核落在由LEU253、GLU154、GLY298 等氨基酸构成的B 口袋；而氧萘母核上的支链取代则伸入到RELA 蛋白的C 口袋。化合物4 中的三部分结构刚好完美地嵌入在RELA 蛋白中的三个不同活性口袋，并通过与周围氨基酸形成一定相互作用力牢固结合在一起，呈现出较强的虚拟活性。

3.2.2 化合物11与RELA 蛋白对接构象分析化合物11 是一个链状化合物，从对接数据上看，化合物11 与各核心靶点的对接数据是最差的。从对接的最佳构象图可以看出（图3），化合物11 主要占据RELA 蛋白的B 口袋和C 口袋，其中酯基端伸入B 口袋，烷基端嵌入C 口袋，但未能占据RELA 蛋白的A口袋。

图3 化合物11与RELA蛋白对接最佳构象图

通过比较化合物4和化合物11与RELA 蛋白的对接数据和对接构象（化合物4 和化合物11 的叠加构象见图4），我们可初步推断，RELA 蛋白中的A 活性口袋在整个活性位点中扮演着重要的角色，淫羊藿中抗骨关节炎活性成分要发挥抗炎作用，首先要占据RELA蛋白的A活性口袋。

图4 化合物4和化合物11与RELA蛋白对接的叠加构象图

本研究利用分子对接的方法模拟了淫羊藿中21个抗骨关节炎活性化合物与6个潜在抗骨关节炎核心靶点的结合模式和相互作用。结果显示，21 个活性成分中大部分与各蛋白的对接数据较好，呈现出较强的虚拟抗骨关节炎活性。对接数据表明，淫羊藿中抗骨关节炎活性成分对潜在核心靶点有一定的选择性，主要是通过抑制RELA 蛋白发挥抗炎作用。化合物4、化合物6 和化合物13 等几个结构类似的活性成分与RELA 蛋白对接的数据要优于其他化合物，估计抑制常数均达到纳摩尔级水平。化合物11是所有活性成分中对接数据最差的。

对接构象上，本研究以RELA 蛋白为代表靶点，分析了虚拟活性差距较大的化合物4 和化合物11与靶蛋白的相关作用和结合模式。对接构象显示，化合物4 能够完全占据RELA 蛋白中的A、B、C 三个活性口袋，其中黄酮母核结构占据了A口袋，母核上的两个羟基分别与VAL300和HIS252两个氨基酸形成氢键相互作用力，而化合物4 中氧萘母核落在RELA 蛋白活性位点的B 口袋，氧萘母核的支链取代基则伸入到由ILE249、ASN251 及ALA73 等氨基酸构成的C 口袋。化合物4 中的三部分结构刚好完美地嵌入在RELA 蛋白中的三个不同活性口袋，是其呈现出较强的抗骨关节炎虚拟活性的基础。

从化合物4 和化合物11 的叠加构象图看，化合物11 只伸入了RELA 蛋白中的B、C 两个活性口袋，未能像化合物4 一样占据A 活性口袋，导致其对接数据与化合物4 等虚拟活性较好的成分相差较大，我们初步推断RELA 蛋白中的A 活性口袋在整个活性位点中扮演着重要的角色。

综上，我们预测淫羊藿中抗骨关节炎成分发挥抗炎作用对潜在核心靶点有一定的选择性，主要作用于RELA 蛋白；化合物4、化合物6 及化合物13 等结构类似的化合物能够完全占据RELA 蛋白的三个活性口袋，与蛋白结合牢固，相互作用较强，表现出对该蛋白较强的虚拟活性，可能是淫羊藿中最活性最高的抗骨关节炎成分。