九里香酮在小鼠尿液中代谢产物的研究

赖郅昊，何智霖，谭佳伟，陈治希，李林福，施伟梅，吴龙火

（1.赣南医学院2020级硕士研究生；2.赣南医学院药学院，江西 赣州 341000）

九里香（Murraya exotica L）为芸香科九里香属植物，气香，味苦、辛，其叶、根、皮和果实均可入药，有行气止痛、活血散瘀等功效［1-2］。研究表明，九里香具有抗炎镇痛、抗菌抗氧化等药理作用，这可能与其富含黄酮类化合物有关［3-4］。九里香酮（5，7，3’，4’-四甲氧基黄酮，5，7，3’，4’-Tetramathoxyfla‑vone，TMF）是九里香叶中黄酮类的一种主要化合物，可显著下调软骨细胞中NO 的水平，下调NO 诱导的Bim表达，保护软骨细胞，但具体作用机制尚不完全清楚［5-6］。也有研究认为九里香酮的保护软骨细胞的作用并非九里香酮直接作用，而是九里香酮的代谢产物发挥作用［7-9］。因此，研究九里香酮化合物的体内代谢对进一步阐明九里香及其黄酮类化合物抗骨关节炎药效的物质基础具有重大意义。

代谢组学是以生物体液为研究对象，运用系统的研究手段考察生物体系受刺激或扰动后其代谢产物的变化，从而反映生物体体内的生物学过程变化情况［10-11］。与疾病相关的代谢组学方法与应用研究是目前代谢组学研究的热点之一［12-14］，广泛应用于病变标志物的发现、疾病的诊断、治疗和预后判断。

目前，其主要的研究平台有核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）。液质联用（LC-MS）是由超高分离度、超快速分离的超高效液相（UPLC）与高灵敏度、高分辨的飞行时间质谱（TOF）结合而成的UPLC-MS 技术，能直接分析体液及组织提取物而无须衍生化操作，并可获得化合物的准确分子量及丰富的结构信息，已发展成为代谢组学研究的主流技术手段［15-16］。本实验采用超高效液相-四级杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）对九里香酮（TMF）在小鼠尿液中的代谢产物进行分析鉴定。探索TMF 在小鼠体内的代谢模式及TMF的作用途径，为明确其药效物质基础和代谢机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料超高效液质联用仪Xevo G2-XS QTof［沃特世科技（上海）有限公司］；超纯水机ED115（美国赛默飞世尔科技公司）。

香叶木素分析对照品（纯度＞98%，北京索莱宝科技有限公司）；3，4，5，7-四甲氧基黄酮（纯度＞98%，北京索莱宝科技有限公司）；乙腈（HPLC 级，美国Fisher 公司），去离子水（自制）；采血管（3.8%枸橼酸钠1∶4，河北鑫乐科技有限公司）。

健康SPF 级KM 小鼠，8 周龄，体重（40±5）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TMF溶液的配制精密称取50.0 mg TMF，置10 mL 容量瓶中，加入PBS 缓冲溶液，使其溶解并定容至刻度，即得质量浓度为5 mg·mL-1的TMF贮备液，于4 ℃冰箱保存；小鼠给药剂量：50 mg·kg-1。

1.2.2 生物样品的收集与处理将6 只小鼠随机分为空白组和给药组，每组3只（雄性），分组后即放入代谢笼中进行饲养，适应喂养7 d 后，提前12 h 禁食不禁水，基于前期抗骨关节炎药效研究结果，按剂量50 mg·kg-1灌胃给药［7］，空白组给同样体积的生理盐水，收集24 h 内的尿液，即时收集，于－20 ℃内保存，备用。

同组小鼠尿液等量合并，移取尿样200 μL，加入20 μL 1 mol·L-1的盐酸，旋涡30 s，加80%甲醇至2 mL，超声15 min 后，在5 000 r·min-1转速下离心15 min，取上清液至于5 mL EP 管中，使用氮吹仪吹干，残渣加入流动相150 μL，超声震荡溶解，在5 000 r·min-1转速下离心15 min，取上清液进行上样。

1.2.3 LC-MS 条件色谱柱：ACQUITY BEH C 18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：30 ℃；流速：0.4 mL·min-1；样量：2 μL；流动相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脱：0～7 min：5%～12%A，7～25 min：11%～

22%A，25～40 min：22%～71%A，40～45 min：71%～80%A，45～46 min：80%～100%A，46～47 min：100%A，47～50 min：100%～5%A。

Xevo G2-XS Tof MS 飞行时间质谱：离子化模式：ESI-；毛细管电压：1.0 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气流量：1 000 L·h-1；MSE低碰撞能量：4.0 V；MSE高碰撞能量：10～45 V；质量范围（m/z）：50～1 200；ESI－模式（m/z）299.0558（香叶木素）。

2 结 果

2.1 小鼠尿液中TMF 代谢产物的分析鉴定通过与空白尿液比较，在含药尿液中共筛选出4 个化学成分，含药尿液总离子流图及M1-M4 的色谱图见图1。结合对照品、色谱保留时间、精确分子质量、多级碎片离子等信息分析，共鉴定了4 个TMF 代谢产物，其二级图谱见图2，其裂解途径见图3。

M1 在m/z 503 处呈现［M-H］－准分子离子，并分别在m/z 1007、327、312、297、269 处呈现［2M-H］－、［M-H-GluA］－、［M-H-GluA-2CH3］－及［M-H-GluA-3CH3-CO］－的碎片离子。M1 被初步推定为木犀草素的三甲基化及葡萄糖醛酸化产物。

M2在m/z 407处呈现［M-H］－准分子离子，并分别在m/z 327、312、297、269 处呈现［M-H-SO3］－、［M-HSO3-CH3］－、［M-H-SO3-2CH3］－及［M-H-SO3-3CH3-CO］－的碎片离子。M2 被初步推定为木犀草素的三甲基化及磺基化产物。

M3在m/z 327处呈现［M-H］－准分子离子，并分别在m/z 312、297、269处呈现［M-H-CH3］－、［M-H-2CH3］－及［M-H-3CH3-CO］－的碎片离子。M3 被初步推定为木犀草素的三甲基化产物。

图1 负离子模式下的色谱图

图2 M1-M4的二级质谱图

M4在m/z 299处呈现［M-H］－准分子离子，并分别在m/z 284、256处呈现［M-H-CH3］－及［M-H-CH3-CO］－的碎片离子。经与对照品比较，M4 被确认为香叶木素。

经SciFinder 数据库检索，M1 和M2 被初步鉴定为新化合物。

图3 M1-M4的裂解途径

3 讨 论

药物进入体内后在各种代谢酶的作用下，产生各种结构形式的代谢产物。这些代谢产物有可能具有活性，当它们进入到相应的靶点后，可发挥药理作用，因此对药物的体内代谢进行研究，有助于解释药物的体内显效形式，进而揭示其药效机制。本文采用UPLC-QTOF-MS 技术从小鼠尿液中鉴定出4 个代谢产物，为木犀草素的甲基化产物以及进一步葡萄糖醛酸基化或磺基化的产物。研究结果提示，TMF 在小鼠体内可能先经过Ⅰ相水解脱除1个或多个甲基后，然后在此基础上继续发生Ⅱ相代谢结合反应如硫酸酯化、甲基化、葡萄糖醛酸化。这与文献推测的代谢途径较为一致［9］。本研究为阐明TMF 的体内代谢途径和显效形式奠定了基础，同时对其安全用药和药理机制研究均有一定参考价值。