C1GALT1C1蛋白在IgA肾病发病中的作用初探及靶向C1GALT1C1 miRNA的筛选

程 丽，陈 雯，赵成波，王润秀，谢富华

（1.赣南医学院生物化学与分子生物学教研室；2.赣南医学院第一附属医院肾内科，江西 赣州 341000）

IgA 肾病（IgA nephropathy，IgAN）是我国最常见原发性肾小球疾病，也是我国导致终末期肾脏病（End-Stage Renal Disease，ESRD）的 重 要 病 因 之一［1］。IgAN 的发病在欧洲和亚洲占原发性肾小球疾病的15%～40%。按病理变化，目前可分为5 型：系膜细胞增生型、内皮细胞增生型、节段性硬化或粘连型、肾小管萎缩或肾间质纤维化型和细胞纤维性新月体型。然而，该病自首次报道以来，半个多世纪过去了，其确切的发病机制尚未完全阐明［2］。不过，肾病研究者们普遍认为β1，3-半乳糖苷酶糖（C1GALT1）活性下降导致糖基化水平下降的IgA1（Under glycosylation IgA1，Ug-IgA1）的形成是IgAN发病的关键所在［3-4］。那么，是什么原因导致β1，3-半乳糖苷酶糖（C1GALT1）活性下降？研究表明C1GALT1 基因未发现有突变和高度甲基化现象，但其伴侣蛋白C1GALT1C1表达下调可能对IgAN 发病起了关键作用。

miRNA 是一类长度为22～25 nt 的非编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，它们能够与靶基因mRNA 分子3′端非编码区（3′-UTR）不完全性地互补结合，在转录后水平调控靶基因的表达，广泛参与到胚胎发育、细胞分化、增殖和凋亡等过程。近来，有研究表明IgAN患者外周血或尿液中存在许多差异表达的miRNA，这对于疾病的诊断和预后判断具有一定的意义。因此，本研究采用miRNA表达谱测序探讨导致C1GALT1C1 表达下调的可能因素，并对C1GALT1C1 是否参与IgAN 发病进行初探。

1 材料与方法

1.1 细胞株、外周血样本及siC1GALT1C1 慢病毒载体人B淋巴细胞株DAKIKI（购自北京北纳创联生物技术研究院）；IgAN 患者和健康成人（Healthy control，HC）EDTA 外周抗凝血来自赣南医学院第一附属医院；siC1GALT1C1 及阴性对照慢病毒载体购自上海吉凯基因。

1.2 主要仪器与试剂RPMI-1640 培养基、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、胎牛血清和RNA 提取试剂购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；人外周淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司。SYBR Green Ⅰ和cDNA 逆转录试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；二奎琳甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；Ug-IgA1 ELISA 试剂盒购自日本IBL 生物有限公司；anti-C1GALT1C1 和anti-ACTIN 购 自 美 国Cell Signaling Technology公司。化学发光成像仪和实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad Laboratories，Inc.。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养DAKIKI 细胞株购自北纳生物科技有限公司，细胞悬浮培养于含10% FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的RPMI-1640培养基中，37 ℃、正常湿度，5%二氧化碳孵箱，每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。当细胞培养基颜色变黄时，离心按1∶3 传代。实验中所用细胞均处于对数生长期。

1.3.2 外周血单核淋巴细胞总蛋白质提取与Western blot 检测经分离得到的外周血单核淋巴细胞采用放射免疫沉淀实验裂解液（Radio immunoprecipitation assay，RIPA）法提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度；蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转膜，脱脂牛奶封闭，4 ℃孵育抗体过夜，洗膜后孵育二抗，增强化学发光（Enhanced chemiluminescence，ECL）显色曝光。

1.3.3 siC1GALT1C1 慢病毒载体感染效率与基因沉默效率检测接种DAKIKI细胞于6孔板；24 h后给予病毒（MOI=10，下文均采用该值感染细胞）；病毒感染后72 h 荧光显微镜观察细胞形态变化，并收集细胞采用1.3.2 中所述方法行Western blot 检测C1GALT1C1和ACTIN蛋白。

1.3.4 ELISA 检 测DAKIKI 细 胞Ug-IgA1 水 平DAKIKI 细胞接种于12 孔板，24 h 后按MOI=10 的量给予病毒感染细胞，以携带siNC 慢病毒载体为阴性对照，以PBS 为空白对照，每组设3 个复孔。病毒感染后72 h 收集细胞上清，3 000 rpm 离心5 min，取上清置于冰上，立即按IBL公司的Ug-IgA1 ELISA 检测试剂盒操作。

1.3.5 外周血单核淋巴细胞的提取与miRNA 表达谱测序及其结果分析收集入住我院经肾活检确诊为IgAN 患者以及健康成人的外周静脉EDTA抗凝血约9 mL，按照人外周淋巴细胞分离试剂盒说明分离获取外周血单核淋巴细胞，液氮速冻后干冰寄送至深圳华大基因科技有限公司行miRNA 表达谱测序。获得测序数据后，选择差异表达2倍以上的miRNA 应 用pictar、targetscan、miRanda 和miRBase软件行miRNA 进行靶基因预测，将至少出现在3 个软件中的基因作为可能的靶基因；对预测的靶基因进行GO 功能聚类和KEGG Pathway 功能分析；筛选一批以C1GALT1C1为靶基因的miRNAs。

1.3.6 外周血单核淋巴细胞总RNA 提取与miRNA 表达验证采用Trizol 提取细胞总RNA，取100～200 ng 细胞总RNA，按PrimeScript RT Reagent Kit试剂盒（TaKaRa）说明进行miRNA 的逆转录反应（采用茎环引物法）；取适量cDNA，使用SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ试剂盒（TakaRa）和特异性引物进行荧光定量PCR。反应结束后，以U6为内对参，以SYBR Green Ⅰ为染料采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。每个处理组设3个复孔，最终结果取3次独立实验的结果。

1.4 统计学方法为减小观察误差，采用3次测量取平均值作为最终观测值的方法。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）方法比较三组指标均数，并用SNK法进行两两比较，检验水准α=0.05。实验数据采用SPSS 20.0软件包进行统计学分析。

2 结 果

2.1 IgAN 外周血单核淋巴细胞C1GALT1C1 蛋白表达下调我们收集了11 例经肾活检确诊为IgAN 的患者［Lees分级Ⅲ级3例，Ⅳ级3例，未分级5例；年龄（37.4±11.8）岁，P＞0.05］和6 例HC 的外周抗凝血样本，分离外周血单核淋巴细胞后RIPA法提取细胞总蛋白，取部分样本进行Western blot检测，实验结果表明相对于HC，IgAN 患者的C1GALT1C1蛋白的平均水平下调约40%（P＜0.05，如图1所示）。

2.2 慢病毒介导DAKIKI 细胞C1GALT1C1 基因表达下调病毒感染DAKIKI 细胞后72 h，几乎所有细胞均表达绿色荧光蛋白（如图2A所示），表明慢病毒成功介导siC1GALT1C1表达载体进入该细胞并被表达；进一步通过蛋白印迹实验发现siC1GALT1C1组C1GALT1C1 蛋白相对于siNC 组下调约20%（P=0.0292，F=6.746；如图2B所示）。

图1 外周血单核淋巴细胞C1GALT1C1蛋白水平

2.3 C1GALT1C1 基因表达下调导致DAKIKI 细胞产生Ug-IgA1慢病毒感染分泌IgA1 细胞系DAKIKI 后72 h，siC1GALT1C1 组相对于siNC 组，其细胞培养上清中糖基化水平低下的IgA1 水平升高（P=0.0046，F=15.01；图3所示）。

图2 慢病毒感染效率及基因沉默效果检测

图3 siC1GALT1C1 对DAKIKI细胞产生Ug-IgA1的影响

2.4 IgAN 外周血单核淋巴细胞靶向C1GALT1C1基因的miRNA 表达谱改变IgAN 外周血单核淋巴细胞中相对于HC，共有1 218 个miRNA 有差异表达，其中有123个miRNA 差异表达在2倍以上（图4A所示），选取高表达排在前10%的miRNA 表达验证，qRT-PCR验证结果基本与测序结果一致。对这123个miRNA 的预测靶基因进行KEGG 聚类分析发现它们主要聚集于IL17、Cytokine-cytokine receptor 和Kemokine 等细胞因子信号通路（图4B 所示，红色箭头标记）；并从中筛选出25 个以C1GALT1C1 为靶基因的miRNA（图4C所示）。

图4 IgAN miRNA表达谱分析及靶向C1GALT1C1基因的miRNAs筛选

3 讨 论

IgAN 是一种肾小球系膜区以IgA 或IgA 免疫复合物沉积为主的原发性肾小球疾病。它的流行在不同洲、不同国家或在一个国家不同地区的分布差异很大，如亚太地区（中国、日本和新加坡等）、欧洲、北美洲国家该病的发病率分别占原发性肾小球疾病的40%～50%、20%、8%～12%［5］。IgAN 是我国最常见原发性肾小球疾病，是终末期肾脏病的重要病因之一。然而，遗憾的是IgAN的确切发病机理至今仍未完全阐明，其发病机制复杂，影响因素众多，目前认为其发病的原因可能是由于患者体内C1GALT1 的活性下降使血循环中IgA1 铰链区糖基化水平低下，进而导致这种缺陷型IgA1 及其免疫复合物在肾小球系膜区沉积进而诱发炎症［3-4，6］。近来，有研究发现C1GALT1 的分子伴侣C1GALT1C1在IgAN 患者中表达下调，但C1GALT1C1 对于该病的发病是否具有关键作用以及是什么原因导致其表达下调等问题仍有待进一步阐明。

目前，关于miRNA 和IgAN 的研究较少，近来有学者发现IgAN 患者肾脏组织和尿液中存在较多差异表达的miRNA［7-12］。还有学者从IgAN患者外周血单核细胞中筛选出一种可能靶向C1GALT1 的miR-148［8］，但是他们并未提及靶向C1GALT1C1 的miRNA。

为了证实伴侣蛋白C1GALT1C1 是否参与了IgAN的发病，我们收集了11例IgAN外周血样本，检测发现患者C1GALT1C1蛋白平均水平下降，这与国内外研究结果一致。然后通过慢病毒表达载体介导在一种能持续分泌IgA1 细胞系DAKIKI［13-14］中发生C1GALT1C1 RNAi，结果发现当C1GALT1C1 基因被部分沉默时，可导致细胞内糖基化低下的IgA1（Ug-IgA1）水平升高，而Ug-IgA1 的产生以及持续存在于血循环中被认为可能是IgAN发病的关键环节。因此，我们认为伴侣蛋白C1GALT1C1表达下降可能对IgAN 发病起了关键作用。为了寻找导致C1GALT1C1蛋白表达下降的原因，我们进行了miRNA表达谱测序。测序结果发现共有1 218个miRNA 有差异表达，其中有123 个miRNA 差异表达在2 倍以上，对这123 个miRNA 的预测靶基因进行KEGG 聚类分析发现它们主要聚集于IL17、Cytokine-cytokine receptor 和Kemokine 等细胞因子信号通路，这提示炎症在IgAN发病中也起了重要的作用。同时，我们筛选到25 个靶向C1GALT1C1 基因的miRNA，这对该病的诊断和预后可能具有较为重要的指导作用。