利用生物信息学分析鉴定与骨关节炎相关的潜在核心基因

张珊珊，杨江辉，邓豪成，张 曼，刘 海，吴龙火，张 蕊

（1.赣南医学院2020级硕士研究生；2.赣南医学院2017级制药工程专业本科生；3.赣南医学院2018级制药工程专业本科生；4.赣南医学院药学院，江西 赣州 341000）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是现今非常流行的一种致残性疾病［1］。它是一种常见的肌肉骨骼疾病，导致人们生理功能和生活质量下降。在临床上，该病的特点是关节疼痛、骨骼脆弱、骨质疏松、僵硬和运动限制，偶尔会伴随输液和局部炎症的不同程度的疼痛，而持续性的疼痛往往为该疾病后期的一个特征［2］。在组织学上，这种疾病的特点是软骨表面的早期分裂，软骨垂直裂口的形成，软骨细胞的克隆，可变晶体沉积以及重塑［3］。但退行性疾病过程不仅影响关节软骨，还涉及整个关节，包括亚侧骨、胶囊、韧带、突触膜和关节周围肌肉［4］。

导致OA 的风险因素有很多，如年龄、性别、肥胖、过度的关节使用、营养、骨矿物质密度等［5］。目前OA 尚不可治愈，也没有有效的治疗方法来阻止其进展。现有的药物治疗，有些可以作用于关节软骨，如合成代谢药物Sprifermin，它是短的重组人FGF-18 蛋白，可诱导软骨细胞增殖，促进细胞外基质的生成［6］；有些可以作用于软骨下骨，如破骨细胞抑制剂二磷酸盐，它可以抑制破骨细胞的功能，在骨代谢异常的状况下可降低骨量的丢失、提高患者的骨密度，有显著抑制关节软骨下骨骨量丢失的作用，保护软骨下骨的骨微结构，有助于改善软骨附着结构［7］。这些药物使用的主要目的是能使患者病情有所缓解，但它们都无法明显快速地影响疾病的进展，而且某些药物的慢性摄入可能导致不良反应［8］。而且对于一些晚期严重的OA 患者还必须进行关节置换手术。

目前为止，OA 仍然是一种治疗效果不佳且治疗方案选择有限的疾病，因此，探索OA 新的治疗靶点是当务之急。近年来随着基因芯片技术的快速发展，其在研究各种疾病基因表达谱和寻找疾病相关基因中发挥了重要作用［9］。基因芯片技术高通量筛选得到的生物标志物有可能作为与OA 相关的不同病理过程的衡量标准。可以通过检测OA 的软骨降解，反映OA 相关的生物活性和为预测疾病进展的进程提供有用的诊断信息，细胞因子和酶以及细胞外基质成分如胶原蛋白和蛋白酶的前体或降解产物，都有作为OA 生物标志物的潜力［10］。尽管许多相关的研究正在进行，但目前还没有可靠的、可量化的、易于测量的生物标志物来对骨关节炎的早期诊断、治疗和预后提供监测。本研究从高通量基因表达（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库下载了包含正常半月板组织、OA 患者半月板组织的基因芯片（GSE19060），利用生物信息学技术，分析得到OA 相关的差异表达基因，并对其进行功能富集分析，构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络，进一步筛选出核心基因，为OA 的防治提供筛查标志及新的治疗靶点，并以期从分子水平揭示OA的发病机制。

1 材料和方法

1.1 芯片数据来源本研究中分析的基因表达数据是从GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库下载。经过仔细分析，选择了芯片数据集GSE19060，其芯片平台是GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 DEGs 数据处理用GEO2R 在线分析工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）分析正常半月板组织样本和OA 半月板组织样本，得到差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs），筛选DEGs 的标准是：|logFC|≥2 及adjust P＜0.05，FC（Foldchange）是基因表达差异倍数。对得到的DEGs 使用Heml 1.0 绘制热图，以便直观地看到上调和下调表达的DEGs变化。

1.3 利 用GO 和KEGG 分 析DEGsGO（Gene Ontology）分析是大规模功能研究常用的分析方法，其对基因功能的研究可分为3 个方面，即生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）［11］。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是一个被广泛使用的数据库，它存储大量有关基因组、生物通路、化学物质、疾病和药物的数据［12］。本研究中的GO 注释分析和KEGG 路径富集分析使用的是DAVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）工具数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）。选择的标准是：P＜0.05和基因计数≥5。

1.4 PPI 网络构建和核心基因的确定利用在线数据库STRING（Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes，http：//string-db.org/）检索分析PPI信息，筛选的条件是：combined score＞0.4，之后利用Cytoscape 软件（www.cytoscape.org/）将PPI 网络可视化。在这个网络中具有更高连接度的节点在维持整个网络的稳定性方面更为重要，Cytoscape 软件中的插件CytoHubba 根据连接度来计算每个蛋白质节点的分数。在我们的研究中，分数最高的前10个基因被确定为核心基因。

2 结 果

2.1 DEGs 的筛选本研究选择的芯片数据集是GSE19060 该芯片共包含8 例样本，其中3 例正常半月板组织，5 例OA 半月板组织，基于筛选标准|logFC|≥2 及adjust P＜0.05，比较正常组织和OA 组织从GSE19060 中总共筛选出106 个DEGs，包括52个上调表达基因，54 个下调表达基因。对得到的DEGs进行聚类分析，其结果如图1所示。

图1 骨关节炎差异表达基因聚类图

2.2 DEGs的功能富集分析将筛选得到的106个DEGs 用DAVID 做GO 和KEGG 富集分析，GO 的分析结果包括3个方面，即生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），GO 分析结果（表1）表明DEGs 生物学过程主要和细胞外基质的组织、细胞粘附、细胞增殖的负调控、细胞因子的信号通路调控、信号转导有关；细胞组分主要和细胞外区域、细胞膜、突触后密集区、转录因子复合物、细胞外基质、神经元胞体、突触后膜、轴突、蛋白质细胞外基质、质膜有关；分子功能主要和肝素结合有关。KEGG分析结果（表1）显示DEGs所涉及的信号通路主要是PI3K-Akt 信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节等过程。

表1 GO和KEGG富集分析结果

2.3 DEGs 的PPI 网络构建使用STRING 工具分析预测DEGs之间的蛋白质相互作用。如图2所示，PPI 网络中总共涉及94 个节点蛋白和281 个相互作用关系，图中的每一个圆点代表一个蛋白，红色的圆点代表上调表达的蛋白，绿色的圆点代表下调表达的蛋白，两个点之间的连线代表两个蛋白具有直接作用的关系。一个蛋白如与多个蛋白都有线相连，则代表这个蛋白与多个蛋白均有相关作用关系，这就意味着，与一个蛋白相连接的蛋白点越多，代表这个蛋白在整个网络中的作用越重要。

2.4 核心基因的确定使用Cytoscape 软件以及插件CytoHubba，确定了PPI网络中处于关键位置的十大核心基因，结果如表2 所示，分别是SFRP4、SFRP1、ITGB2、EPHA4、ELN、IGFBP5、FMOD、SYNPO2、PITX2、DSP。为了直观地看到这10 个核心基因之间的相互作用，用Cytoscape 软件将这10个核心基因可视化，如图3 所示，核心基因用黄色、橙色、红色标注，颜色越深的基因代表在整个网络中起的作用越重要。

图2 DEGs的PPI网络构建

表2 Cytoscape分析得到的10个核心基因

图3 与OA相关的十个核心基因

3 讨 论

OA 是一种复杂的疾病，通过结构、机械和生物通路的共同作用，导致关节成分退化的疾病［13］，是一个发病过程缓慢且需要高效的修复过程，这个修复过程用来补偿最初的创伤、代谢、系统变化，结果会导致关节的结构改变，但没有症状的发生。然而，有一些人中，由于修复能力受损，无法得到补偿，导致持续性组织损伤，最终出现明显症状和“关节衰竭”［14］。其发病机制尚未明确，找到与之相关的信号通路和生物标记物对治疗和预防OA十分必要。

现在的很多研究都是探索单个基因对OA 的影响，但在OA 进程中往往会涉及多个基因表达的改变，并且某些基因表达的改变还会影响其他基因的表达、基因之间相互作用，通过调控网络对OA 的发生发展起到作用，可见在多基因水平研究OA 的基因表达有助于阐明其发病机制。基因芯片是新一代的高通量检测技术，可以同时检测上万个基因的表达水平，是一种研究基因组和基因间相互作用的有效手段［15］。

本研究首先从公共基因芯片数据库（GEO）下载骨关节炎相关芯片数据（GSE19060），利用GEO2R工具筛选OA 和正常组织之间的DEGs，共发现106个DEGs，其中52个上调表达，54个下调表达。基因表达量的改变往往会造成生物体生物学过程、分子功能、细胞组分的变化，用GO 分析注释发现主要涉及细胞外基质的组织、细胞粘附、细胞增殖的负调控、细胞因子的信号通路调控、信号转导、细胞外区域、细胞膜、突触后密集区、转录因子复合物、细胞外基质、神经元胞体、突触后膜、轴突、蛋白质细胞外基质、质膜、肝素结合等。KEGG 信号通路分析发现主要和PI3K-Akt 信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节等过程相关。之后用STRING 工具构建PPI 网络，由Cytoscape 软件将DEGs 可视化，并筛选出SFRP4、SFRP1、ITGB2、EPHA4、ELN、IGFBP5、FMOD、SYNPO2、PITX2、DSP 等10 个连接度最高的与骨关节炎发病机制相关的核心基因。

我们对得分最高的3个蛋白进行了文献的查阅和研究进展的总结。分泌卷曲蛋白相关蛋白4（Se‑creted frizzled related protein 4，SFRP4）和分泌卷曲蛋白相关蛋白1（Secreted frizzled related protein 1，SFRP1）是SFRP 家族的一员，该家族含有一个富含半胱氨酸的结构域，与卷曲蛋白的Wnt结合位点同源。Wnt信号转导级联是软骨发育、稳态和退化的主要调节途径，SFRPs是Wnt信号的可溶性调节因子，被认为是Wnt蛋白的拮抗剂。CARMEN GARCIA-IBARBIA等研究发现在优势比为2.73 的女性中，SFRP4 与膝关节骨性关节炎相关，该分子以性别和关节特异性的方式影响大关节骨关节炎的遗传易变性［16］，但是具体的作用机制并没有做深入的研究。S THYSEN 等发现在OA 进程中，SFRP1 主要在软骨下骨中发挥作用，而不是在关节软骨内稳态中发挥作用［17］。SFRP1 基因缺失能增加小梁骨量，减少成骨细胞和骨细胞凋亡［18］。此外，SFRP1 还可能通过结合核因子-kappaB配体（Nuclear factor-kappaB ligand，RANKL）抑制破骨细胞形成，核因子-kappaB 配体是成骨细胞表达的配体，通过与其同源信号受体RANK15 相互作用，促进破骨细胞分化［19］。在STR/ort 小鼠中，SFRP1 表达的减少不仅导致Wnt/catenin 信号激活增加，而且使关节软骨易于过早老化和促进OA 的发展［20］。整合素亚基β2（Integrin subunit beta 2，IT‑GB2）的基因编码一个整合素链，它与多个不同的链结合形成不同的整合素异源二聚体，整合素是整合的细胞表面蛋白，参与细胞粘附以及细胞表面介导的信号传导，该编码蛋白在免疫反应中起重要作用，该基因的缺陷导致白细胞粘附缺陷［21］。ITGB2在许多芯片研究分析中都发现与OA相关［22-23］，但是相关的具体实验验证尚比较缺乏，有待进一步研究。EPH 受体A4（EPH receptor A4，EPHA4）属于蛋白酪氨酸激酶家族的ephrin 受体亚家族，目前没有其与OA有关的报道，值得进一步研究。