荧光 PCR探针熔解曲线法检测老年肺结核患者耐药性的价值

王智慧 董雅坤 池跃朋 邸红芹 梁亚充 谢兰品

随着人口老龄化，老年肺结核及耐药患者的逐年增加已成为全世界结核病流行的普遍现象，若不能及时确诊，极易误诊误治，严重影响老年结核病患者的治疗转归。因此，对老年耐药肺结核患者的早期诊断和治疗十分重要。笔者应用荧光PCR 探针熔解曲线法检测老年肺结核患者结核分枝杆菌(MTB)临床分离株对一线抗结核药品的耐药性，以评价该方法检测老年耐药肺结核患者的临床应用价值。

资料和方法

一、研究对象

回顾性搜集2018年9月至2020年10月河北省胸科医院收治的159例年龄≥65岁的老年肺结核患者作为研究对象，所有患者肺结核诊断明确[1]，具有影像学检查阳性体征、BACTEC MGIT 960培养阳性、对硝基苯甲酸(PNB)鉴别培养基生长试验初步菌种鉴定为MTB，且临床资料充分。其中，男101例(63.52%)，女58例(36.48%)；年龄范围65～90岁，平均年龄(70.8±5.6)岁。

二、研究方法

1.试剂和仪器：BACTEC MGIT 960快速全自动分枝杆菌培养及药物敏感性检测系统和BACTEC MGIT 960液体药物敏感性检测试剂盒(美国BD公司)；EctractorTM34快速核酸提取仪(北京博奥生物集团有限公司)；MTB耐药突变检测试剂盒(包括利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素)、实时荧光定量PCR检测系统、MTB核酸提取试剂均购自厦门致善生物科技股份有限公司；Bio-Rad CFX96 PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)。

2.痰标本前处理及分离培养：取患者0.5 ml 经N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-NaOH消化液处理过的痰液样本重悬液加至含MTB添加剂的液体培养管中，混匀后放入BACTEC MGIT 960液体培养系统中，仪器报阳后取培养液进行初步菌种鉴定。

3.初步菌种鉴定(PNB生长试验)：取1～2 ml分枝杆菌阳性培养液加入至无菌试管中，与标准麦氏比浊管比浊，以0.5%吐温-80生理盐水逐步稀释至10-2mg/ml菌悬液，分别取0.1 ml接种于PNB培养基和改良罗氏培养基(对照)各1支，最终接种菌量为10-3mg，37 ℃孵育，每周观察1次结果并记录培养基上菌落生长情况，直至孵育4周。快速生长的非结核分枝杆菌于1周左右可见菌落；缓慢生长的分枝杆菌需4周报告结果。MTB复合群在 PNB培养基上不生长。对鉴定为MTB的临床分离株进行后续的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。

4.药敏试验：对培养阳性的MTB菌液采用BACTEC MGIT 960药敏试验对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素进行耐药性检测，药物浓度分别为：1、2、4、8 μg/ml，0.2、0.4、0.8、1.6 μg/ml，2.5、5、10、20 μg/ml，1、2、4、8 μg/ml。

5.荧光PCR探针熔解曲线法检测：待测样品加入等量4%NaOH溶液进行液化，按照说明书制备核酸提取液。将2 μl提取好的核酸加入扩增反应液，放入荧光定量PCR仪扩增。取FAM通道的循环阈值(Ct值)<30的核酸提取物进行荧光PCR探针熔解曲线法耐药检测。分别将异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇耐药检测试剂盒平衡至室温、熔解，加入5 μl核酸提取物及PCR混合液和酶混合液，放入实时荧光定量PCR检测系统进行检测。阳性对照为含有相应野生型扩增靶基因的质粒。反应检测程序参照说明书。待测样品和阳性对照之间的熔解曲线熔点差值(Tm)≤1 ℃为野生型，≥2 ℃则为突変，介于1 ℃～2 ℃间则为耐药性不明确。如果同时检出突变峰和野生峰，则报告为异质性耐药。

6.耐药基因测序：对荧光PCR 探针熔解曲线法检测和BACTEC MGIT 960药敏试验结果不一致的样本送至华大基因科技有限公司进行基因测序筛选分析。从利福平的rpoB基因507～533共27个氨基酸密码子区域内(81 bp，利福平耐药决定区)的突变进行筛选；从异烟肼ahpC启动子区(-44～-30 及-15～3位点)、inhA94密码子、inhA启动子区(-17～-8位点)及katG315密码子的突变进行筛选；从乙胺丁醇embB基因的耐药决定区内是否含有突变进行筛选；从链霉素rpsL基因43位密码子和88位密码子及rrs基因513～517位点和905～908位点是否含有突变进行筛选。

三、统计学处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行分析，以BACTEC MGIT 960药敏试验结果为参考标准，分析荧光PCR探针熔解曲线法的敏感度、特异度、符合率；两种方法的一致性检验采用Kappa检验，Kappa值≥0.75为两者一致性较好，0.4≤Kappa值<0.75为两者一致性一般，Kappa值<0.4为两者一致性较差。

结 果

一、 药敏试验结果

159株临床分离株中，药敏试验检测97株(61.01%)敏感，62株(38.99%)耐药；其中，耐利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素菌株分别为59株(37.11%)、61株(38.36%)、40株(25.16%)、43株(27.04%)。

二、 荧光PCR 探针熔解曲线法耐药检测效能

以BACTEC MGIT 960药敏试验结果为参考标准，荧光PCR 探针熔解曲线法对4种一线抗结核药品耐药性的检测效能较好，见表1。

三、基因测序情况

两种检测方法检测MTB临床分离株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素耐药性不一致的菌株分别有4、6、27、31株。其中，荧光PCR 探针熔解曲线法检测为耐药的菌株分别有3、4、22、23株，且经耐药基因测序均发现耐药突变位点，见表2。

讨 论

我国是耐药结核病高负担国家，同时也是人口老龄化大国。因老年患者多伴有呼吸及循环系统等基础疾病，常会掩盖肺结核引起的咳嗽、发热、气短等症状；加之老年患者治疗依从性差、脏器功能衰退、抗结核药物不良反应和不规范抗结核治疗多见[2]，常多次反复治疗，产生耐药[3-4],成为我国结核病传播的重要防治难点。又因为耐药结核病治疗成本高、周期长、治愈率低、死亡率高，早期诊断老年耐药结核病对其早期制定合理化疗方案、提高治疗成功率、降低死亡率、减少耐药MTB传播有积极意义。

表1 荧光PCR 探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌对一线抗结核药品耐药性的效能

表2 不同药品经两种耐药性检测方法结果不一致MTB菌株的耐药基因测序结果

目前，MTB及其耐药性快速检测技术包括BACTEC MGIT 960快速分枝杆菌培养及其药敏试验检测系统、实时荧光定量PCR检测技术、基因芯片技术、GeneXpert MTB/RIF等。传统BACTEC MGIT 960药敏试验耗时需21～28 d，不能及时指导临床用药，导致延误治疗；基因芯片法则操作繁琐，且需PCR后处理，存在扩增产物污染实验室的风险，并只能检测异烟肼和利福平耐药，检测位点相对少；GeneXpert MTB/RIF检测可实现MTB及其利福平耐药性简便快速的自动化检测，但不能检测利福平以外抗结核药品的耐药情况，对临床指导意义有限，且需要专门仪器，价格也较昂贵。本研究采用的荧光PCR 探针熔解曲线法是第三代PCR技术闭管检测，是将扩增和检测两步骤合一，实现了实时扩增实时检测，仅需6～7 h就可准确检测出MTB对多种药品的耐药性情况，可有效指导临床用药，缩短诊断时间[5-6]。

本研究结果显示，荧光PCR 探针熔解曲线法对一线抗结核药品耐药性的检测效能及与BACTEC MGIT 960药敏试验结果一致性均较好，与严虹等[7]和胡春梅等[8]的研究结果一致。进一步对两种检测方法不一致的临床分离株进行基因测序，发现BACTEC MGIT 960药敏检测为耐药、荧光PCR 探针熔解曲线法检测为敏感的菌株，均未检测到基因突变；而在BACTEC MGIT 960药敏检测为敏感、荧光PCR 探针熔解曲线法检测为耐药的菌株中，发现其均存在rpob513、531位点，katG315密码子和inhA-15C启动子区，embB306、406位点，rrs514、517位点和rpsL43、88位点突变。可能原因有：(1)BACTEC MGIT 960药敏试验结果虽然是当前检测MTB耐药的常用标准，但其结果判读中灰区的存在会影响结果判读；(2)乙胺丁醇和链霉素耐药检测结果不一致的菌株较多，可能与MTB对这两种药品耐药不稳定，易发生动态变化有关[9]；(3)荧光PCR 探针熔解曲线法只是筛选核酸序列而不是氨基酸序列，可能会将那些不引起氨基酸改变的突变(沉默突变)判定为突变型；(4)检测样品中可能含有杂合耐药菌株，需要结合熔解曲线峰型才能判断突变比例。若杂合耐药株中耐药菌的比例低于40%时，可能会导致熔解峰与阳性对照一致，而将试验菌株判定为对药品敏感，造成假阴性结果；(5)基因测序方法仅能测定已知的耐药基因，对其他基因或基因区引起的突变以及其他耐药机制引起的耐药则不能测定出来。

综上，荧光PCR 探针熔解曲线法检测老年肺结核患者对一线抗结核药品的耐药性结果与BACTEC MGIT 960药敏检测结果一致性较好，且检测快速、敏感度高、特异度强，可早期指导临床用药及后期动态监测。值得注意的是本次研究样本量较少，且基因突变位点检测均在已知位点中筛选，故研究结果存在一定局限性。