Simple-QuEChERS Nano结合GC-MS/MS同时检测全血中的97种农药

2021-03-25董林沛任昕昕王爱华张云峰

分析测试学报 2021年3期

王丹，董林沛，任昕昕，姜红*，王爱华，常靖，张云峰，张曦

(1.中国人民公安大学侦查学院，北京 100038；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038；3.岛津企业管理(中国)有限公司，北京 100020)

我国是农业大国，也是农药生产与使用大国。近年来，由农药引发的负面问题受到人们的广泛关注，由于生产、存储、运输及使用不当造成意外中毒的事件以及自杀、投毒等案件时有发生[1]。因此，快速准确地检验血液中的农药，不仅能够帮助公安机关查明涉案农药，对判断案件性质、分析案情及后续侦破工作也具有重要意义。

目前，血液中农药的检测方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[2]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[3]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[4]等。其中，GC-MS/MS具有灵敏度高、选择性强、抗干扰能力强等优点，采用的多反应监测模式(Multiple reaction monitoring，MRM)可有效消除GC-MS选择离子扫描模式(Selected ion monitoring，SIM)常出现的假阳性问题。与LC-MS/MS相比拥有成本低、维护便捷、抗污染能力强、易于普及迭代等特点，是复杂基质中农药分析的理想技术[5]。血液中存在大量血细胞、磷脂、脂肪、甘油三酯及蛋白质[6]，基质成分复杂，且通常情况下血液中的农药浓度较低，从血液中提取农药的同时减少或消除基质成分的干扰已成为分析过程中最关键的步骤。血液中农药常用的样品前处理方法包括液液萃取法[7]、固相萃取法[8]和QuEChERS方法[9]等。一步净化QuEChERS纳米材料小柱(Simple-QuEChERS Nano)方法由传统QuEChERS方法改进优化，以多壁碳纳米管(MWCNTs)替代石墨化碳黑(GCB)、Carbon等吸附材料，可增强净化能力，提高灵敏度，并且净化过程能够一步完成，无需振荡、离心等操作步骤，大大节省了前处理时间，已应用于茶叶[10-11]、蔬菜[12-14]等基质中农药残留的检测，但未见用于血液中农残分析的报道。

本研究采用Simple-QuEChERS Nano结合气相色谱-串联质谱技术，建立了血液中97种农药(50种有机磷类农药，15种氨基甲酸酯类农药，18种拟除虫菊酯类农药，12种除草剂，2种其他农药)的分析方法，并将其应用于实际案件血液中农药的筛查与定性定量工作，获得良好的效果。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

GCMS-TQ8050 NX(日本Shimadzu公司)；DB-5ms色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司)；CUTE MIXER CM-1000型高速振荡器(日本Tokyo Rikakakai公司)；Thermo-Fisher Biofuge Primo R型台式高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；Milli-Q Direct水纯化系统(德国Merck Millipore公司)。

甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；Simple-QuEChERS Nano(简单基质)净化柱(含5 mg MWCNTs、150 mg PSA和900 mg MgSO4)及Simple-QuEChERS Nano(复杂基质)净化柱(含25 mg MWCNTs、150 mg PSA和885 mg MgSO4)购自北京绿绵科技有限公司；MF-3301QuSEL多功能针式过滤器(含50 mg PSA)和AOAC-3202QuSEL多功能针式过滤器(含50 mg PSA、50 mg C18和150 mg MgSO4)购自天津阿尔塔科技有限公司；97种农药100 μg/mL混合标准溶液(溶于丙酮，天津阿尔塔科技有限公司)。实验用水为一级水。

空白全血样品购自北京复兴医院。

1.2 样品制备

取0.5 mL全血样品于15 mL塑料离心管中，加入1.5 mL水，涡旋混匀后加入2.0 mL乙酸乙酯，振荡10 min，以8 000 r/min离心10 min。在Simple-QuEChERS Nano净化柱下端加装0.22 μm有机微孔滤膜，取上清液加入净化柱中，使用推杆缓慢下压净化柱顶部(控制液滴速度在1～2 滴/秒)，使上清液通过净化层和滤膜进行净化和过滤，滤液用进样小瓶收集，供GC-MS/MS分析。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件：Agilent DB-5ms色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯氦气(99.999%)，恒线速度模式，线速度：45.6 cm/s；进样口温度：260 ℃；升温程序：初始温度60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至320 ℃，保持5 min；不分流进样，进样体积：1 μL。

质谱条件：电子轰击离子源(EI源)，离子源温度200 ℃，接口温度320 ℃，溶剂延迟时间2 min，扫描方式为多反应监测模式(MRM)，扫描间隔0.3 s，碰撞气为高纯氩气(99.999%)。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

采用甲醇稀释配制质量浓度均为10 μg/mL的97种农药混合标准溶液，选择Q3Scan采集模式，在m/z45～500范围内检测，选择丰度高且质荷比大于100的特征离子作为母离子。设置碰撞能(CE)范围为3～45 eV，使用产物离子扫描方法进一步得到各目标物的最佳CE电压以及离子丰度比值，建立MRM分析方法，得97种农药的保留时间与质谱参数见表1。使用1 μg/mL混合标准溶液验证MRM方法离子对优化结果，总离子流色谱图见图1。

图1 1 μg/mL混合标准溶液的总离子流色谱图

表1 97种农药的保留时间与质谱参数

(续表1)

2.2 前处理方法优化

2.2.1 基质条件优化全血中存在丰富的血细胞、大分子蛋白质、多糖及脂质，基质较为黏稠。直接使用有机溶剂提取时，仅33种农药的回收率在70%～120%范围内，并且拟除虫菊酯类农药的回收率均低于70%。研究发现，加入适量水稀释可使提取溶剂与样品充分接触，提高萃取效率。全血经3倍水(体积比1∶3)稀释后再使用有机溶剂提取，净化前回收率在70%～120%范围内的农药数量增至57种，其中包括所有的拟除虫菊酯类农药。因此选择将全血用3倍水(体积比1∶3)稀释后提取。

2.2.2 进样口及提取溶剂优化法庭科学毒物分析领域使用QuEChERS方法时，乙腈沉淀蛋白的效果最佳，是首选提取溶剂，但其与气相色谱-质谱联用时，由于乙腈极性强，长期使用会造成色谱柱填料流失，降低柱效，增加仪器维护频次。因此乙腈作为提取溶剂时，常配合液相色谱-质谱来检测，或采用搭载程序升温进样口(Program temperature volume，PTV)的气相色谱选择性地去除样品中的乙腈[15]。本实验选择质量浓度为10 μg/mL的混合标准溶液(溶于乙腈)，通过优化进样口升温程序，建立了97种农药基于PTV进样的MRM方法，采用空白全血配制100 ng/mL的97种农药样品，经乙腈提取后选择建立的PTV进样的MRM方法分析，将结果与乙酸乙酯萃取后采用SPL进样的结果进行比较。结果显示，PTV进样可有效除去溶剂、抑制进样口歧视，并能得到更好的峰形。但本方法中97种农药种类多，沸程宽，仅用一个程序升温进样容易造成低沸点目标物(如涕灭威分解物、灭多威、敌敌畏、乙拌磷亚砜等)随溶剂排出而无法测定，同时高沸点杂质滞留在衬管中，并吸附目标物导致样品重复性较差。此外与传统的SPL进样口相比，搭配PTV进样口使用的衬管内径较小，抗污染能力较差，对于基质较为复杂的生物样品大量进样，需搭配更为严格的样品净化步骤。综上所述，对于目标物种类较多的筛查检测方法宜选用传统的SPL进样口进样，因此，本方法排除了乙腈作为提取溶剂。

相较于乙腈，乙酸乙酯和正己烷的极性较小，适用于气相色谱分析。实验考察了乙酸乙酯以及乙酸乙酯-正己烷(体积比1∶1)混合溶剂的提取效率。结果显示，以乙酸乙酯-正己烷(体积比1∶1)提取时，农药的回收率普遍较低，21种农药的回收率低于70%，极性强的农药(如亚胺硫磷、莠去通、内吸磷、3-羟基克百威)的回收率均低于40%，而单独使用乙酸乙酯提取时，上述4种农药的回收率提高至71%～91%，且78种农药的回收率在70%～120%范围内，因此选择乙酸乙酯为提取溶剂。

表2 4种市售净化柱的净化材料及用量

2.2.3 净化材料优化QuEChERS方法常用净化材料包括乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、GCB、C18、中性氧化铝、Fe3O4磁性纳米颗粒以及近年来出现的新型净化材料Enhanced Matrix Removal Lipid(EMR-Lipid)、MWCNTs等。其中PSA可有效去除有机酸、脂肪酸、糖类等杂质，GCB主要用于吸附色素，C18对于油脂类物质具有较强的吸附力，中性氧化铝主要去除脂肪酸、色素和油脂等杂质，EMR-Lipid适用于肾脏、肝脏等生物组织，MWCNTs可有效去除水溶性和脂溶性杂质，MgSO4主要用于除水[16]。通常根据基质的复杂程度和杂质成分选择单一净化材料或多种材料组合对提取溶液净化，各材料的使用量也会影响净化效率和回收率。实验比较了Simple-QuEChERS Nano(简单基质)净化柱、Simple-QuEChERS Nano(复杂基质)净化柱、QuSEL多功能针式过滤器(MF-3301)、QuSEL多功能针式过滤器(AOAC-3202)4款市售净化柱的净化效果，其净化材料和用量见表2，净化后的回收率见图2。结果显示，QuSEL多功能针式过滤器中MgSO4含量较低，无法有效除水，增强了离子响应，导致农药回收率普遍偏高。MWCNTs吸附性强，Simple-QuEChERS Nano(复杂基质)净化柱中装填了25 mg MWCNTs，在有效去除杂质的同时吸附了部分农药，使其回收率下降。Simple-QuEChERS Nano(简单基质)净化柱能有效净化提取液，且对目标农药的影响最低，因此选择Simple-QuEChERS Nano(简单基质)净化柱对提取液净化。

图2 不同净化材料对100 ng/mL加标人血样品中各农药提取回收率的影响(n=3)

2.3 方法学验证

采用空白全血基质配制农药质量浓度分别为10、25、50、100、200、500 ng/mL的系列基质匹配标准工作溶液，在优化条件下测定，以各目标物的质量浓度(x)为横坐标，对应定量离子对色谱峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，以3倍和10倍信噪比(S/N)对应的添加水平分别计算各目标物的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，结果见表3。各农药在一定质量浓度范围内线性良好，相关系数(r2)不低于0.987 3。除丙烯菊酯的LOD和LOQ分别为11.03、36.76 ng/mL外，其余96种农药的LOD为0.06～4.27 ng/mL，LOQ为0.18～14.24 ng/mL。

采用空白全血，设置目标物的加标浓度分别为100、200、400 ng/mL，在优化条件下测定，计算各目标物的回收率。另采用空白全血基质配制质量浓度为100 ng/mL的混合标准溶液，重复测定6次，连续测定5 d。结果显示，97种农药的回收率为32.2%～120%，日内精密度(RSD)为1.9%～11%，日间RSD为3.6%～13%。

表3 97种农药的线性范围、相关系数、回收率、日间RSD、日内RSD、检出限与定量下限

(续表3)

2.4 实际样品分析

2020年5月，河南省泌阳县某村村东侧河沟内发现一具男尸，经当地公安机关确认为余某，失踪约半月。取死者心血和稀释100倍后的胃内容物，利用本方法进行筛查和检验，均检出联苯菊酯(图3)，浓度分别为37.3 ng/mL和22.5 ng/g(稀释后)，为法医判定死因提供了参考。该结果表明建立的方法能够用于实际血液样品中农药的检测。