基于响应面法的蟹味菇原生质体制备与再生条件优化

冯婷婷，宋天磊，春 霞，刘超雄，李亚娇，慕宗杰，孙国琴，于传宗，王海燕，郭九峰

（1.内蒙古大学 物理科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010021；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

蟹味菇（Hypsizygus marmoreus），是食用菌界的新秀，属担子菌亚门、伞菌目、白蘑科、玉蕈属，又名真姬菇、斑玉蕈、玉蕈等，外形美观、口感独特，低热量、低脂肪，是一种药食兼用的珍贵食用菌，含有较丰富的SOD、CAT、胆碱等天然抗氧化活性物质，具有高营养价值和保健价值，王金梅等[1]研究表明，蟹味菇多糖对环磷酰胺所致小鼠免疫功能抑制有一定的影响，蟹味菇多糖可显著改善由环磷酰胺所致小鼠脾脏指数下降。在市场上颇受欢迎。其子实体含有丰富的维生素、粗蛋白、粗脂肪、多糖、多肽、氨基酸和多种人体必需的矿物质，特别是菌柄，所含营养种类丰富[2-3]。此外，蟹味菇的菌盖具有较高的清除超氧自由基、羟自由基能力[4-5]。目前，我国的蟹味菇工厂化栽培已具有一定规模[6-7]。

对蟹味菇的育种研究也取得一定进展，董先茹等[8]对蟹味菇菌株离子束诱变选育进行了研究，筛选出综合营养价值最高的诱变菌株。以原生质体为材料选育优良菌株在微生物食用菌领域已广泛应用[9-12]，张卉等[13]通过对姬松茸原生质体进行紫外诱变，获得了液体培养条件下高产胞外多糖的诱变菌株。基于原生质体的敏感性[14]，以蟹味菇原生质体为试验材料，进行诱变、菌种选育等领域的研究。同时，菌种改良、原生质体诱变、原生质体融合等均对原生质体的产量和再生率有一定的前提要求，因此，优化蟹味菇原生质体的制备及再生条件有重要价值。此外，响应面法较正交试验方法精度更高，能够得到更可靠的结果，目前在蟹味菇原生质体制备及条件优化方面未见报道。

本研究以蟹味菇菌丝体为材料，以原生质体制备产量、再生率为指标，对制备条件：菌龄、渗透压稳定剂种类、溶壁酶浓度和酶解时间进行单因素试验和响应面法优化，旨在获得蟹味菇原生质体制备和再生的最佳条件，为原生质体的融合、体细胞诱变、基因编辑等研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料 蟹味菇菌株，由内蒙古自治区离子束生物工程重点实验室保留。溶壁酶，购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2 供试培养基 PDA 加强液体摇瓶培养基：180～200 g/L去皮马铃薯，10 g/L蔗糖，10 g/L葡萄糖，1.6 g/L蛋白胨，1.6 g/L酵母提取粉，1.0 g/L K2HPO3，0.5 g/L MgSO4。

PDA 固体培养基：成分同液体培养基，另添加琼脂10 g/L。

原生质体再生培养基：180～200 g/L去皮马铃薯，10 g/L蔗糖，10 g/L葡萄糖，10 g/L 琼脂，1.6 g/L蛋白胨，1.6 g/L 酵母提取粉，1.0 g/L K2HPO3，0.5 g/L MgSO4，硫酸链霉素100 mg/L。

1.2 试验方法

1.2.1 蟹味菇菌丝体活化培养 蟹味菇菌丝体，切取0.3 mm×0.3 mm 小方块状，接种至PDA 固体培养基活化2次，25℃恒温暗培养观察。

1.2.2 菌丝体液体摇瓶培养 取固体培养活化所得菌丝体，同切取3 mm×3 mm 小方块状，接种至PDA液体摇瓶培养基，于摇床150 r/min，25℃恒温暗培养观察。

1.2.3 蟹味菇原生质体的制备 0.6 mol/L甘露醇：称取10.93 g甘露醇溶于100 mL 无菌水。经0.22 μm 微孔过滤器灭菌后备用。2%溶壁酶：称取0.02 g 溶壁酶溶于1 mL 渗透压稳定剂。经0.22 μm微孔过滤器灭菌后备用。

取液体摇瓶培养一定时间后的球状菌丝体200 mg 于2 mL 离心管中，依次用无菌水和渗透压稳定剂洗涤，4 000 r/min 离心5.5 min，弃上清。加入溶壁酶200 μL，恒温摇床培养，待酶解后，加入适量甘露醇洗涤3 500 r/min 离心5 min，取上清液用无菌脱脂棉过滤，过滤后离心，弃上清后所得即纯化后的原生质体液。将所得原生质体稀释适当倍数后，在光学显微镜40倍镜下，用XB-K-25 型号血球计数板计数，重复计数3次，取平均值。

1.2.4 原生质体的再生 取制备后的原生质体，调整到合适的浓度，取200 μL，涂板于原生质体再生培养基，重复3次。

1.2.5 单因素试验 分别探究制备条件：菌龄、渗透压稳定剂种类、溶壁酶浓度和酶解时间对原生质体的制备产量及再生情况的影响。（1）菌龄：固定溶壁酶浓度2 %，渗透压稳定剂0.6 mol/L甘露醇，酶解时间3 h，探究菌龄：5、6、7、8、9 d 对原生质体的制备产量及再生情况的影响。（2）渗透压稳定剂种类：固定溶壁酶浓度2 %，渗透压稳定剂浓度0.6 mol/L，酶解时间3 h，菌龄7 d，探究不同渗透压稳定剂：蔗糖、甘露醇、NaCl 对原生质体的制备产量及再生情况的影响。（3）溶壁酶浓度：固定渗透压稳定剂0.6 mol/L甘露醇，酶解时间3 h，菌龄7 d，探究溶壁酶浓度：1%、2%、3%，对原生质体的制备产量及再生情况的影响。（4）酶解时间：固定溶壁酶浓度2%，渗透压稳定剂0.6 mol/L甘露醇，酶解时间3 h，菌龄7 d，探究酶解时间：2、3、4、5 h 对原生质体的制备产量及再生情况的影响。每组处理重复3次。

1.2.6 响应面试验模型的建立 基于单因素试验的结果，以原生质体的制备产量为响应值，制备条件：菌龄、溶壁酶浓度和酶解时间为自变量，设计三因素三水平的响应面设计及试验（表1）。

表1 响应面试验因素与水平

1.2.7 数据处理 使用Design-Expert 8.0.6、SPSS 22.0、Excel、Origin2017 软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同菌龄对原生质体的制备产量及再生情况的影响 由图1a、图1b可见，随着菌龄的增加，原生质体的制备产量先增加后减少，在95 %置信度下，第7 天和第8 天时制备产量显著增加，在菌龄为7 d时达最大产量8.85×107个/mL。在6、8、9 d时原生质体再生率增加，第6 天时效果最佳，再生率达1.502 %。

图1 不同菌龄对蟹味菇原生质体产量（a）及再生率（b）的影响

2.1.2 不同种类渗透压稳定剂对原生质体的制备产量及再生率的影响 不同种类的渗透压稳定剂对于原生质体的制备产量和再生率的影响各异。由图2a、图2b可见，以甘露醇为渗透压稳定剂时，原生质体产量最多，制备效果最好，差异显著。相比之下，以蔗糖和NaCl为渗透压稳定剂时，效果较差。而以蔗糖为渗透压稳定剂时，原生质体再生率最高，其次为甘露醇、NaCl，在95 %置信度下，再生率显著较高。综上，在后期制备及再生试验中选择甘露醇为渗透压稳定剂。

2.1.3 不同溶壁酶浓度对原生质体的制备产量及再生率的影响 由图3a可见，随着溶壁酶浓度的增大，原生质体的制备产量呈增长趋势，浓度为2%、3%时较1%时效果明显，浓度为3 %时制备产量最多，达9×107个/mL。由图3b可见，原生质体再生率随溶壁酶浓度的增大呈先增加后减少趋势，在95%置信度下，溶壁酶浓度为2 %时，再生率最高，为0.067%。

图2 不同渗透压稳定剂对蟹味菇原生质体产量（a）及再生率（b）的影响

图3 不同溶壁酶浓度对蟹味菇原生质体产量（a）及再生率（b）的影响

2.1.4 不同酶解时间对原生质体的产量及再生情况的影响 随着酶解时间的增加，原生质体产量逐渐增加，在5 h时最高，2 h时产量最低。同时，随着酶解时间的变化，原生质体再生率总体呈下降趋势，在2 h和4 h时再生率较高，2 h时最高（图4）。

图4 酶解时间对蟹味菇原生质体产量（a）及再生率（b）的影响

2.2 响应面法优化

基于响应面法设计试验（表2），对试验数据进行拟合分析，建立多元二次回归模型如下：

Y=120.4+1.47A+2.33B-19.18C+0.23AB-1.92AC-3.8BC-74.77A2-40.65B2-38.3C2

由表3可知，F值为10.89，P＜0.05，表明该模型显著相关，相关系数R2=0.933 3，校正决定系数R2Adj=0.847 6，失拟项P=0.176 4＞0.05，失拟项不显著，表明模型对实验拟合良好，可以用该模型分析和预测结果。A2、B2、C2对结果的影响极显著（P＜0.01），C 对结果的影响显著（P＜0.05），表明A、B、C 三因素对原生质体的制备产量影响的顺序为酶解时间＞溶壁酶浓度＞菌龄。

表2 响应面试验结果

2.2.1 交互作用响应面法分析 由图5可知，3种情况下的交互作用响应面图等高线均未呈现明显的椭圆形，说明因素之间的交互作用不显著。相比之下，结合3D 曲面和等高线形状，交互项对蟹味菇原生质体的制备产量的影响强弱依次为：菌龄和溶壁酶浓度、菌龄和酶解时间、溶壁酶浓度和酶解时间。

2.2.2 最佳制备条件确定与验证 在渗透压稳定剂选定为甘露醇的情况下，经Design Expert 8.0.6 软件分析，得到蟹味菇原生质体最佳制备条件：溶壁酶浓度2.04%、菌龄7.01 d、酶解时间3.75 h，预测制备产量为122.881×106个/mL，为了试验方便，将各条件值取为：溶壁酶浓度2 %、菌龄7 d、酶解时间4 h，在此条件下，根据所得最优条件进行平行试验验证，试验重复3次，得到蟹味菇原生质体制备产量为（120.40 ±1.5）×106个/mL，与预测值相近，表明具有良好的拟合性，由响应面法优化得到的最佳制备参数可靠。

表3 模型方差分析

3 讨论与结论

以原生质体为试验对象和媒介可以打破细胞壁和远缘杂交的障碍，避免繁杂的遗传标记问题，在体细胞杂交、诱变、融合以及新型微生物菌种选育和改良技术、基因组重排技术等生物学研究领域，已获得稳定遗传、性状优良的新品种[15-18]。随着科学与技术的发展，在种质资源创新和新型品种选育的研究中，原生质体都有广泛的应用潜力和前景。制备高产量和高再生率的原生质体是后续生物学研究的关键一步，具有重要的研究意义。已有研究表明对于不同的菌种，菌龄、酶浓度、种类、温度、pH值等条件对原生质体制备的产量和再生率影响不同[19-21]。

图5 两因子交互作用的响应面

单因素试验结果表明，蟹味菇原生质体最佳的制备条件为菌龄7 d+0.6 mol/L甘露醇为渗透压稳定剂+溶壁酶浓度2%+酶解5 h。再生率最佳的制备条件为菌龄6 d+0.6 mol/L甘露醇为渗透压稳定剂+溶壁酶浓度2%+酶解3 h。响应面设计优化结果显示，选择0.6 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂为前提，经优化，最佳制备条件为菌龄7 d，溶壁酶浓度为2%，酶解4 h，经检验与模型预测值有良好的拟合性，相比单因素结果更可靠。酶解时间、溶壁酶浓度、菌龄三因素对原生质体制备产量影响的顺序为酶解时间＞溶壁酶浓度＞菌龄，以响应面法确定的最佳制备条件可获得较高的原生质体产量和再生率。该研究可为蟹味菇原生质体的诱变、融合、育种提供理论参考。