基于SSR标记的甜菜种质资源遗传多样性及群体结构分析

赵尚敏，李晓东，付增娟，鄂圆圆，张 辉，王 良，张自强，郑文哲，张必周，白 晨，张惠忠

（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

甜菜是我国北方主要经济作物之一，目前生产上使用的甜菜品种99%以细胞质雄性不育系材料为母本，优良授粉系材料为父本杂交选育而成。在育种工作中，为了选配出优良的杂交组合，获得优异的创新品种，非常有必要对甜菜种质资源材料进行鉴定分析，进一步明确种质的遗传背景及内在遗传结构，从而可以更有效、准确地选择父母本，避免配制杂交组合的盲目性，进一步提高杂交选育工作效率[1-2]。

随着分子生物学技术的进一步发展，以分子标记为基础的DNA标记为种质资源鉴定提供一个简便准确的方法。DNA标记可以覆盖整个基因组，能客观、准确地检测DNA 水平基因组的差异，能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系[3-4]。利用分子标记确定材料之间的亲缘关系、遗传距离及遗传差异，可以进一步划分杂种优势群，提升杂种优势的潜力，从而显著提高育种的预见性与选择效率[5-7]。近年来，甜菜种质资源的研究主要集中在遗传多样性的研究上，学者们利用不同分子标记技术对不同来源的甜菜资源材料进行了分类[2-3]。这些研究充分显示了甜菜种质资源丰富的遗传多样性和复杂的遗传背景，但对于甜菜群体结构分析的研究鲜有报道。

目前，群体结构分析在玉米[8]、水稻[9]、大豆[10]等作物中已得到了广泛应用，但关于甜菜群体结构的研究尚未开展[11]。本研究采用SSR标记对70份甜菜资源材料的遗传多样性和群体结构进行了分析，以期为揭示甜菜种质资源的进化关系、加快甜菜种质资源的利用效率和优良亲本的选配提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

本研究采用70份甜菜资源材料，其中，9份甜菜单胚不育系材料、11份单胚保持系材料、48份多胚授粉系材料、2份单胚雄性不育杂交种（表1）。这些材料是进行甜菜杂交育种的骨干亲本材料，对甜菜育种起着至关重要的作用。

1.2 DNA 提取、检测

在田间采集70份甜菜资源材料的新鲜嫩叶，将采集的甜菜样品按编号分装好，放入真空冷冻抽干机冻干并研磨成粉，采用CTAB法，提取基因组DNA。然后采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 纯度，利用紫外分光光度计测定浓度[12]。

1.3 PCR 扩增体系

SSR引物选用实验室已筛选并验证的多态性好、条带清晰的12 对SSR引物（表2），均由上海生工合成。PCR 扩增体系为10 μL。PCR 扩增程序为94℃，预变性5 min，94℃变性0.5 min，退火（引物不同，退火温度不同）1 min，72℃延伸0.5 min，32个循环，72℃保温5 min[13]。PCR 扩增产物使用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳结束后进行银染显色，观察并统计条带。

1.4 数据统计与分析

以DL2000DNA Marker 作为分子量参考，每个SSR位点，各组样品在相同迁移率上有带记为1，无带记为0，建立SSR 分子标记的1/0 矩阵数据库。通过Cervus 3.0.7，计算样品的群体遗传多样性。利用Pop Gen 1.32 软件分析引物的等位基因数、等位基因频率和Shannon-Wiener 多样性指数，并计算各个SSR位点的多态性信息量（polymorphism information content，PIC）。利用Structure 软件对供试材料进行群体结构分析，从而确定群体的分组及个体的分配。采用混合模型设置K值范围为1～12，每个K值运算重复5次，将MCMC（markov chain monte carlo）设置100 000次迭代，初始burn-in次数为100 000。若似然值随亚群数的增大而增大，则采用△K 确定合适的K值。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性及遗传多样性分析

利用12 对SSR引物对70份甜菜样品进行扩增（图1、图2分别为引物Y1、Y2 对70份材料的扩增电泳图），在70份材料中扩增出等位基因52个，每对引物的等位基因数为2～6个，平均等位基因数为4.33个；观测杂合度（Ho）为0.06～0.60，平均为0.22；期望杂合度（He）为0.15～0.97，平均值为0.69。衡量种群遗传多样性用杂合度作为一个参数，若杂合度越高，则该种群遗传多样性越丰富[14]。因期望杂合度受取样的影响较小，一般使用期望杂合度衡量种群的遗传多样性，而不是观测杂合度。该供试材料的期望杂合度相对较高，表明该供试材料遗传多样性较丰富。

表1 供试资源材料

表2 所选引物序列及实验条件

多态信息含量（PIC）为0.10～0.96，平均为0.65。由BOSTSEIN 等[15]提出的PIC指标，用基因变异程度高低来衡量。当PIC＞0.5时，为高度多态位点；0.25＜PIC＜0.5时，为中度多态位点；PIC＜0.25时，为低度多态位点。在本试验中，检测到的PIC 平均值0.648 大于0.5，进一步说明70份供试材料的遗传差异较大，遗传背景较复杂（表3）。

2.2 群体结构分析

群体结构分析是预先将供试材料设定几个类群，然后通过标记结果计算每个位点的遗传相似性比例和等位基因频率，从而可以进一步统计出材料之间的共祖度，从更微观角度表明各材料的遗传背景[16]，遗传相似性比例高的材料划分在一个类群。

图1 引物Y1 对70份材料的DNA 扩增结果

图2 引物Y2 对70份材料的DNA 扩增结果

表3 12 对SSR标记的遗传多样性参数统计

该研究采用Structure 软件对70份甜菜资源材料进行分析，确定群体分组和个体的分配。结果显示，自然对数ln P（D）值在K＝6时取得最大值（图3），因此参照EVANNO 等[17]的统计模型，确定亚种群的K值为6，将70份甜菜种质资源分为6个亚群（分别命名为G01～G06，表4）。分析各亚群发现，G01亚群由25份材料组成，在群体结构图中用浅红色标注，该亚群包括单胚不育系材料4份、单胚保持系材料4份、单胚杂交种1份、多胚授粉系材料16份；G02亚群由2份材料组成，在群体结构图中用蓝色标注，这2份材料都是多胚授粉系材料；G03亚群由10份材料组成，在群体结构图中用绿色标注，该亚群包括单胚不育系材料2份、单胚保持系材料2份、多胚授粉系材料6份；G04亚群由16份材料组成，在群体结构图中用黄色标注，该亚群包括单胚不育系材料1份、单胚保持系材料2份、多胚授粉系材料13份；G05亚群由8份材料组成，在群体结构图中用深红色标注，该亚群包括单胚不育系材料1份、单胚保持系材料2份、单胚杂交种1份、多胚授粉系材料5份；G06亚群由9份材料组成，在群体结构图中用棕色标注，该亚群包括单胚不育系材料1份、单胚保持系材料2份、多胚授粉系材料6份。具体群体分类情况见图4。

图3 K值曲线图

通过Structure 软件群体结构的分析，当某一资源材料在某一亚群中的百分比Q值越大，则认为该资源材料血缘关系相对比较单一，否则认为该资源材料血缘关系来源较复杂[18]。表5为70份甜菜资源材料在各个亚群中的Q值分布。70份甜菜资源材料中有31份Q＜0.6，占所有参试材料的44.3%，Q≥0.8 和Q≥0.9的材料分别占22.9%和10.0%，说明各群体中小部分材料亲缘关系比较单一，血缘是独立的，大部分材料亲缘关系比较复杂，相互渗透，含有其他类群的基因成分，与多态性分析结果一致。

表4 70份甜菜资源材料在各组群中的分布（K=6）

图4 70份甜菜资源材料的群体遗传结构分析

表5 各群体Q值分布

2.3 群体主成分分析（PCA分析）

基于SSR标记多态信息，对供试材料进行主成分分析（principal components analysis，PCA），得到材料的主成分聚类情况。根据距离近表示亲缘关系近，距离远则亲缘关系远的原则，通过PCA分析，可以知道哪些材料相对比较接近，哪些材料相对比较疏远。70份资源材料PCA 聚类情况见图5。本研究通过PCA分析划分为4 部分（a、b、c、d），划分结果与群体结构划分的6个类群基本对应：在PCA 聚类图的a部分是G01、G05类群总和，说明这两个类群之间亲缘关系比较近，b 部分和G03类群对应，c 部分对应G04类群，d 部分对应G06类群，G02类群没有归在a、b、c、d 任何一个部分，且与a、b、c、d 部分距离比较远，说明G02类群的材料与其他类群材料亲缘关系比较远，血缘是独立的。PCA 划分的4个部分间有少量材料相互渗透（图5），6个类群差异显著，在PCA分析图中距离也较远，因此PCA分析所得的结论和群体结构分析的结果两者基本上是吻合的，进一步说明群体结构分析的准确性。

图5 群体主成分分析

3 结论与讨论

亲本资源是育种工作的基础，明确育种基础材料遗传多样性、遗传背景及遗传结构，对选育新品种有非常重要的作用。该研究对70份甜菜资源材料进行了遗传多样性分析，结果表明，该研究供试材料的期望杂合度较高，平均为0.69，表明供试材料遗传多样性较丰富；多态信息含量（PIC）平均为0.65，大于0.5，说明70份供试材料的遗传差异较大，遗传背景较复杂；但由于PIC值在0.10～0.96，变化范围比较大，进一步说明有些材料遗传差异极其明显，但有些材料差异很小。

群体结构分析将70份甜菜资源材料分为6个亚群，其中，G01亚群25份材料、G02亚群2份材料、G03亚群10份材料、G04亚群16份材料、G05亚群8份材料、G06亚群9份材料，除G02亚群只包括授粉系材料外，其余亚群既包括不育系与保持系，也包括授粉系。70份材料中，Q＜0.6的占44.3%，Q≥0.8 和Q≥0.9的分别占22.9%和10.0%，根据Q值的大小，进一步说明各群体中小部分材料亲缘关系比较单一，血缘是独立的，大部分材料亲缘关系比较复杂，相互渗透，含有其他类群的基因成分，与多态性分析结果一致。

主成分分析进一步验证了群体结构的准确性，分析的结果两者基本上是吻合的，进一步分析了群体之间的亲缘远近。根据距离近表示亲缘关系近，距离远则亲缘关系远的原则，可知同一类群材料间亲缘性最近，G01 与G05类群材料间亲缘性较近，G02类群与其他类群亲缘性最远，且血缘是独立的，遗传背景较单一。

通过该研究的分析，进一步反映了亲本材料间遗传多样性、遗传背景及内在的遗传结构。在育种工作中，可以更有针对性地对材料加以选择和利用。决定甜菜育种成败的关键是亲本选配，在选择亲本材料作为杂交育种亲本时，除考虑材料间的亲缘关系外，还要考虑其复杂的遗传组分[19]，尽可能挑选亲缘关系相对较远，遗传背景不同的材料作为父母本，这样才能提高杂种优势，有助于选育出更好的后代杂交创新品种，对指导甜菜杂交育种工作与未来的甜菜育种研究具有重要指导意义。