晾制密度对雪茄烟叶非挥发性有机酸代谢的影响

卢绍浩 张嘉雯 赵喆 赵铭钦 钟秋 宋朝鹏 张瑞娜 张华述

摘  要：为明确晾制密度对雪茄烟叶非挥发性有机酸代谢的影响，以德雪1号为试验材料，研究了竿距15、25和35 cm的晾制密度对晾房温湿度、叶片含水率、化学成分、非挥发性有机酸含量以及苹果酸脱氢酶（MDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）和柠檬酸合酶（CS）活性的影响。结果表明，随着晾制的进行，各处理含水率和苹果酸含量均呈下降趋势，柠檬酸和丙二酸含量呈上升趋势，草酸含量整体变化不大;MDH活性先升高后降低，CS活性一直升高，而SDH活性逐渐降低。晾制过程中，在竿距25 cm的晾制密度下，晾房内温湿度适宜，能提高雪茄烟叶MDH、SDH和CS活性以及柠檬酸和草酸含量，降低苹果酸和丙二酸含量，并且晾制后各化学成分较协调。因此，雪茄烟叶在晾制过程中，将晾制密度控制在竿距25 cm能提高烟叶非挥发性有机酸代谢能力，促进烟叶内在物质转化，提高烟叶品质。

关键词：晾制密度;雪茄烟叶;非挥发性有机酸;酶活性;化学成分

Abstract： In order to clarify the effect of air-drying density on non-volatile organic acid metabolism of cigar tobacco leaves， taking Dexue No.1 as the test material， the effects of three treatments （stick distance of 15， 25 and 35 cm） on the temperature and humidity of the drying room， tobacco leaf moisture content， the chemical composition， the content of non-volatile organic acids， and the malate dehydrogenase （MDH）， succinate dehydrogenase （SDH） and citrate synthase （CS） activities were studied. The results showed that with the progression of air-curing， the moisture content and malic acid content showed a downward trend， the citric acid and malonic acid contents showed an upward trend， and the overall change of the oxalic acid content was not significant. The activity of MDH increased first and then decreased， CS activity increased all the time， while SDH activity gradually decreased. Under the drying density of 25 cm， the temperature and humidity in the drying room were suitable， which can increase the MDH， SDH and CS activities and the contents of citric acid and oxalic acid， reduce the contents of malic acid and malonic acid of tobacco leaves， and the chemical components were coordinated. Therefore， the air-curing density with a length of 25 cm can improve the metabolism of non-volatile organic acids， promote the conversion of internal materials， and improve the quality of tobacco leaves.

Keywords： air drying density; cigar tobacco leaf; non-volatile organic acid; enzyme activity; chemical composition

有机酸在烟草生长发育过程中起着重要作用，它们既是合成大分子的中间物质，也是呼吸作用的中间产物[1]。其中，烟草中的非挥发性有机酸是影响烟草吸食品质的主要化学成分，尤其是苹果酸、柠檬酸、草酸和丙二酸，它们占烟叶总质量的5%～10%，并且可与金属离子结合成盐或脂类形式，降低烟叶重金属的毒害[2]，同时在燃吸时可平衡烟气酸碱度，减轻刺激性，提高吸味醇和度[3]。赖燕华等[4]研究表明，丙二酸对卷烟感官品质起负面作用，草酸和柠檬酸起正面作用。张锦韬等[5]通过灰色关联分析表明，草酸主要影响刺激性和劲头，苹果酸主要影响劲头和浓度，柠檬酸主要影响刺激性和浓度。因此合理调控烟叶内各非挥发性有机酸含量，对提高烟叶内在质量及感官品质具有重要意义。雪茄烟是一种直接由烟叶卷制而成的特殊的烟草类型，优质的雪茄烟叶是卷制高品质雪茄的基础，其内在物质含量直接決定了雪茄烟的吸食品质[6]。烟草调制是烟叶内在化学成分转化的关键时期，不同的调制措施对烟叶内含物质的转化可产生不同效果。晾制密度是雪茄烟叶调制管理中的一项重要技术措施，可通过改变烟叶间隙来影响烟叶的失水速率及温湿度，从而影响烟叶酶活性，最终对内含物质进行调节[7]。目前，调制措施对烟草有机酸的研究主要集中在烤烟和白肋烟方面[8-9]，但关于雪茄烟叶有机酸代谢研究甚少。本试验将通过探究不同晾制密度对雪茄烟叶有机酸代谢规律及相关酶活性的影响，为优化雪茄烟叶调制工艺及提高雪茄烟叶品质奠定理论基础。

1  材料与方法

1.1  试验田概况

试验于2019年在四川省什邡市大泉坑村雪茄烟叶生产基地（东经104°09′，北纬31°18′，海拔539 m）进行。试验田土壤为水稻土，有机质含量34.35 g/kg，碱解氮含量118.47 mg/kg，速效钾含量83.69 mg/kg，速效磷含量35.28 mg/kg，pH 6.34。

1.2  试验设计

选用当地主栽品种德雪1号为试验材料，于2019年4月30日移栽，行距120 cm，株距40 cm，按照当地优质雪茄烟叶生产技术规范统一管理，烟田施氮量为180 kg/hm2（烟草专用复合肥），最终使m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶0.5∶3。采收时选取大田叶片长势和成熟度相对一致的烟株，以中部叶（第10～12叶位）为试验材料，将采摘后的烟叶编竿挂入晾房，挂竿长200 cm，每竿挂45片烟叶，每个处理烟叶标记30竿，按相邻两竿间距设置3个处理：15 cm高密度（M1）、25 cm中密度（M2）、35 cm低密度（M3），将各处理分别挂入3座相同晾房的同一区域（晾房规格为：长×宽×高=30 m×10 m×8 m），采用避光晾制，重复3次。雪茄烟叶晾制分为凋萎期、变褐期、定色期和干筋期4个时期，在晾制第0、5、10、15和20天进行取样，共取5次。每次选取各处理烟叶30片分成3份，1份用于烟叶含水率的测定;1份用于相关酶活性的测定;1份去除主脉和叶尖杀青后，将其烘干磨碎过60目筛，用于化学成分的测定。

1.3  测定指标与方法

1.3.1  温湿度测定方法  晾制开始时，将Deli9012温湿度计（宁波得力电子商务有限公司）挂入每个密度处理的中心处，共挂9个，分别在晾制0、5、10、15和20 d的8：00—20：00时间段内，每隔4小时记录温湿度计上的读数。

1.3.2  含水率测定方法  将整片烟叶叶尖处1/3和叶基处1/3去除，放入（100±1）℃的烘箱中，采用烘箱法[10]测定雪茄烟叶的含水率。

1.3.3  有机酸代谢关键酶活性  苹果酸脱氢酶（MDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、柠檬酸合酶（CS）活性分别按照相应酶试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司生产）方法测定。

1.3.4  非挥发性有机酸含量测定方法  采用YC/T 288—2009《烟草及烟草制品多元酸的气相色谱法》测定苹果酸、柠檬酸、丙二酸和草酸含量[11]。

1.3.5  化学成分含量测定方法  烟叶化学成分含量采用流动分析法测定[12]。

1.4  数据分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据整理及作图，运用SPSS 21.0进行数据分析。

2  结  果

2.1  晾制密度对晾房温湿度及烟叶含水率的影响

由表1可知，随着晾制的进行，晾房内温度逐渐升高，而湿度则呈先上升后下降变化，在晾制5 d达到峰值;在相同时间内，随着晾制密度的增加，晾房内温湿度均增加。在晾房内温湿度影响下，不同处理雪茄烟叶含水率均呈下降趋势，处理间比較，烟叶含水率表现为M1>M2>M3。在晾制0～5 d，晾房湿度逐渐增加，此时烟叶含水率降幅较小，之后晾房湿度逐渐下降，在10～15 d下降较快，导致烟叶含水率迅速降低。因此在整个晾制过程中，烟叶失水速率呈现“慢-快-慢”的变化。

2.2  晾制密度对雪茄烟叶有机酸代谢相关酶活性的影响

MDH、SDH和CS是植物体内三羧酸循环的关键限速酶，对植物有机酸代谢起着重要作用。由图1A所示，不同处理雪茄烟叶MDH活性均呈先上升后下降的趋势，在晾制15 d达到峰值，此时M1、M2和M3处理酶活性分别为23 188.72、26 945.99和20 312.68 nmol/（min·g）。不同晾制时间MDH活性均表现为M2>M1>M3，并且晾制5～15 d内M2处理与M1和M3差异显著。随晾制时间的增加，各处理烟叶SDH活性均逐渐降低（图1B）。晾制初期SDH活性最高，但处理间差异不显著。在晾制5 d活性急剧下降，M1-M3处理降幅分别为47.39%、31.06%、57.31%，此时各处理间达到显著差异;晾制10～20 d，SDH活性趋于平缓，均以M2处理最高，与M1差异显著。图1C显示，晾制过程中各处理烟叶CS活性均呈上升趋势，在晾制20 d达到最高，此时M1、M2、M3处理相比于晾制开始时分别提高了1.34倍、1.97倍和1.07倍。在晾制0 d，各处理间差异不显著;在晾制5～20 d，处理间CS活性均表现为M2>M1>M3，M2与M3达显著水平。

2.3  晾制密度对雪茄烟叶非挥发性有机酸含量的影响

晾制期间不同处理雪茄烟叶苹果酸含量均呈下降趋势（图2A），M1-M3处理最大降幅分别为56.02%、58.16%和45.42%。晾制期间苹果酸含量均表现为M3>M1>M2，除晾制初期各处理间无显著差异外，M2处理均显著低于M3。由图2B可知，晾制过程中各处理柠檬酸含量均呈上升趋势。晾制0 d，各处理柠檬酸含量差异不显著，随晾制的进行，柠檬酸含量表现为M2>M1>M3，且除晾制15 d外，各处理均达到显著差异，晾制20 d相较于0 d分别升高了1.79（M1）、2.68（M2）、1.63（M3）倍。与其他有机酸相比，烟叶内丙二酸含量较低（图2C），各处理丙二酸含量均呈逐渐上升趋势，晾制20 d与晾制初期相比，M1-M3处理分别升高了85.36%、83.77%、71.65%。整个晾制期间，丙二酸含量均以M3最高，其次为M1、M2处理;除晾制0 d外，M2与M3处理差异显著。图2D显示，晾制期间各处理雪茄烟叶草酸含量均呈上升趋势，但变化幅度较小。各时期草酸含量均表现为M2>M3>M1，但处理间差异不显著。由此可知，整个晾制过程烟叶内草酸含量变化不明显，且晾制密度对其影响较小。

2.4  晾制过程中非挥发性有机酸与酶活性的相关分析

如表2所示，各处理苹果酸含量与MDH活性均呈显著负相关，与SDH活性均呈极显著正相关，与CS活性呈显著或极显著负相关，其中在M1、M2处理达极显著水平。柠檬酸含量与MDH活性均呈正相关，但相关性不显著，与SDH活性均呈极显著负相关，与CS活性均呈极显著正相关。丙二酸含量与MDH活性均呈正相关，但只有M1处理达显著水平，与SDH活性均呈极显著负相关，与CS活性均呈正相关，但只有M2处理达显著水平。草酸含量与MDH活性关系不明显，与SDH活性均呈负相关，但只有M2处理达显著水平，与CS活性均呈正相关，但只有M1处理达显著水平。

2.5  晾制密度对雪茄烟叶化学成分的影响

由表3可知，M2处理烟叶的总糖、还原糖含量以及两糖比最高，而淀粉含量显著低于M1、M3处理，表明适当的晾制密度能促进淀粉向可溶性糖的转化。蛋白质含量变化范围为4.88%～5.28%，M2处理显著低于M1和M3。其他化学成分处理间则无显著差异。钾氯比作为烟叶燃烧性能的重要指标，在本试验中以M2处理最高。氮碱比作为评价烟叶内在质量的重要依据，数值越接近1烟叶质量越好[13]。表3中，氮碱比以M2处理最接近1，其次是M1、M3处理。综合来看，各化学成分以M2处理更为协调。

3  讨  论

晾制密度可通过调节烟叶间隙，直接影响晾房内的温湿度以及空气流速，进而影响烟叶水分的散失程度，而烟叶水分含量与其内部酶活性及大分子物质的转化密切相关[7，14]。与烤烟相比，雪茄烟叶的晾制条件温和，晾房内环境对烟叶质量形成具有重要影响。本试验结果表明，随晾制密度的加大，晾房温湿度升高，烟叶含水率也增高，这是由于晾制密度大，烟叶间隔小，叶间隙空气流速较慢，温湿度无法及时排除[15]。密度较小时，叶间隙空气流速增加，烟叶水分散失较快，温湿度逐渐下降[7]。因此选择合适的晾制密度对改善晾房内部环境，提高烟叶质量有重要意义。

植物有机酸积累与转化强度与其相关酶活性密切相关[8]。本研究中，随晾制的进行，不同处理烟叶MDH活性均呈单峰变化，晾制15 d达到最高，这是由于晾制期间苹果酸含量呈下降趋势，在一定程度上促进了MDH的活性[16]，晾制后期烟叶失水萎蔫，导致MDH活性急剧降低。而整个晾制时期CS活性持续升高，这是由于晾制期间烟叶内大部分有机酸的减少使pH向碱性方向变化，诱发了CS活性升高[17]，进而促进了柠檬酸的合成，这与宫长荣等[18]在白肋烟上的研究结果相似。SDH是三羧酸循环和有氧呼吸的功能性成分，它串联线粒体基质内琥珀酸到延胡索酸的氧化[19]。宋朝鹏等[1]研究表明，烤烟在烘烤过程中SDH活性逐渐降低。本研究发现，晾制期间雪茄烟叶SDH活性呈下降趋势，这可能由于晾制过程中丙二酸含量升高，有效抑制了SDH的活性[20]。本试验中，高晾制密度和低晾制密度处理均使有机酸代谢关键酶活性处于较低的水平，这是因为高晾制密度的烟叶叶间风速小，温湿度无法排出，造成高温高湿的环境[7]，而低晾制密度的烟叶间空气流速过大，烟叶水分迅速散失，造成水分胁迫，两种环境均不利于维持较长的生命活动，无法满足酶所需要的适宜条件[21]，使有机酸代谢强度下降。适宜的晾制密度与其他处理相比，烟叶失水速率适中，氧化还原较平衡，酶活性相对较高，有利于提高烟叶有机酸代谢的能力，保持有机酸的充分转化，对提高雪茄煙叶吸食品质有重要意义。

有机酸是碳水化合物和含氮化合物的中间产物，间接地调节烟叶中碳氮代谢的进程，进而对烟叶品质产生影响[22]。本研究中，在雪茄烟叶调制过程中，苹果酸含量逐渐降低，这主要是因为其被用于呼吸消耗，或与金属离子结合生成盐[23]。前人研究发现[24]，在苹果酸代谢中MDH起主导作用，本研究中烟叶苹果酸含量与MDH呈显著负相关，M2处理MDH活性最高，促进了苹果酸向草酰乙酸的转化，故苹果酸含量最低。本试验结果表明，烟叶中柠檬酸含量呈上升趋势，这可能是因为晾制期间烟叶CS活性逐渐增加，促进了草酰乙酸向柠檬酸转化，导致柠檬酸含量升高[23]。而M2处理柠檬酸含量最高，这是由于高晾制密度下环境温湿度较高，烟叶呼吸作用较强，加速了柠檬酸的消耗[25];而低晾制密度的烟叶水分迅速散失，烟叶体内生命活动较慢，不利于柠檬酸的转化和形成。赵高坤等[26]研究表明，K326在调制过程中丙二酸和草酸含量均逐渐增加。本试验结果表明雪茄烟具有相似的变化规律，在晾制期间丙二酸和草酸含量均呈上升趋势，这可能由于丙二酸和草酸属于低级脂肪酸，而在晾制过程中高级脂肪酸可通过酶促反应向低级脂肪酸转化[27]。相关性分析可知，丙二酸与SDH间呈极显著负相关，这说明了丙二酸可作为SDH的竞争性抑制剂，有效抑制SDH的活性，故晾制过程中丙二酸含量以M2处理最低。而处理间草酸含量无显著差异，表明了晾制密度对草酸影响较小。

4  结  论

综合来看，不同晾制密度对雪茄烟叶非挥发性有机酸含量、相关酶活性及各种化学成分都有显著 影响，在竿距25 cm的晾制密度下，烟叶内MDH、CS和SDH活性最高，柠檬酸和草酸含量较高，苹果酸与丙二酸含量较低，有助于保证晾制时期有机酸转化的顺利进行，且整体化学成分协调，提高了调制后烟叶质量。因此，雪茄烟叶在晾制过程中，将晾制密度控制在竿距25 cm能提高烟叶非挥发性有机酸代谢能力，促进烟叶内在物质转化，改善烟叶的内在品质。本研究可为优化雪茄烟叶晾制技术提供理论依据。

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