结核感染T细胞斑点试验中结核特异性抗原/植物血凝素比值对肺外结核的诊断价值

黄 健，孙 冰，柴青峰，韩 伟，崔秀琴

(1.新乡医学院第一附属医院结核内科二病区，新乡市结核病学重点实验室，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院第一附属医院结核病研究所，新乡市结核病学重点实验室，河南 卫辉 453100)

结核病是临床常见的感染性疾病，当结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，MTB)经过淋巴系统、血液系统扩散至人体除肺部之外的其他组织和脏器时称为肺外结核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)。EPTB可发生在机体多个器官和组织，约占结核病总数的1/5[1]。因为EPTB易感部位广泛，起病隐匿，临床症状不典型，所以早期诊断较为困难，常易发生漏诊和误诊，影响患者的治疗效果及预后[2-3]。γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assay，IGRA)是通过检测结核特异性抗原(mycobacterium tuberculosis specific antigen，TBAg)刺激T淋巴细胞所产生的γ-干扰素水平，诊断受试者体内是否存在MTB感染的一种检测技术，其已成为结核病诊疗指南推荐的常用实验室检测方法之一[4]。结核感染T细胞斑点试验(tuberculosis infection T cell spot test,T-SPOT.TB)是目前IGRA较常用的检测方法，常规的结果判定方法是根据计数试验中的TBAg——早期分泌靶向抗原-6(early secreted antigenic target-6，ESAT-6)和培养滤液蛋白-10(culture filtrate protein-10，CFP-10)的斑点形成细胞(spot forming cell，sfc)数。因T-SPOT.TB无法区别活动性结核病(active tuberculosis，ATB)与潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)，致使其在像我国这种高结核潜伏感染率国家诊断ATB的特异度不高。近年来已有研究发现，T-SPOT.TB检测结果中的TBAg与植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)比值区分ATB与LTBI的特异度较高，对于鉴别ATB及LTBI有较好的作用[5]。本研究旨在探讨T-SPOT.TB试验中TBAg/PHA比值在诊断EPTB中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年1月至2020年1月新乡医学院第一附属医院收治的522例疑诊EPTB患者为研究对象。纳入标准：(1)临床表现为发热、乏力、盗汗，且根据病变部位不同，伴有淋巴结肿大、头痛、头晕、呕吐、颈项强直、腰背部疼痛、关节疼痛或肿胀、尿路刺激征、血尿、腹胀、腹痛、大便不规律、月经紊乱等至少1项表现；(2)年龄≥18周岁；(3)自愿签署知情同意书。排除标准：(1)妊娠、哺乳期女性；(2)人类免疫缺陷病毒抗体阳性；(3)抗结核治疗超过2周。患者满足以下任一条件即可诊断为EPTB[6-7]：(1)尿液、体液、分泌物或组织涂片抗酸染色或MTB培养阳性；(2)组织病理切片镜下见肉芽肿性炎症，中心见干酪样坏死，周边见郎汉斯细胞，外围见淋巴细胞及纤维结缔组织；(3)符合EPTB相关的临床症状和影像学表现，未获得除结核以外的其他疾病诊断依据，且予以抗结核治疗有效。根据最终是否诊断为EPTB，将患者分为EPTB组(n=209)和非EPTB组(n=313)。EPTB组：男135例，女74例；年龄18～82(48.81±10.46)岁；淋巴结核65例，结核性脑膜炎52例，骨结核50例，泌尿系结核20例，结核性腹膜炎12例，肠结核5例，生殖系统结核5例。非EPTB组：男183例，女130例；年龄19～80(47.11±11.06)岁；淋巴结炎38例，淋巴瘤37例，坏死性淋巴结炎12例，非MTB淋巴结炎3例，结节病3例，病毒性脑膜炎37例，化脓性脑膜炎32例，隐球菌性脑膜炎6例，脑膜转移瘤6例，骨肿瘤18例，类风湿性关节炎15例，强直性脊柱炎10例，布氏杆菌病7例，慢性化脓性关节炎3例，慢性化脓性骨髓炎1例，肝硬化腹水19例，化脓性腹膜炎17例，恶性腹水10例，克罗恩病15例，结肠炎5例，结肠癌3例，阿米巴病2例，泌尿系慢性感染4例，泌尿系肿瘤3例，泌尿系结石2例，睾丸肿瘤1例，子宫内膜异位症2例，慢性盆腔炎2例。2组患者年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获医院医学伦理委员会批准。

1.2 T-SPOT.TB检测方法采集所有患者入院后第2天清晨空腹静脉血5 mL，置于肝素钠抗凝管内，4 h内使用密度梯度离心法分离外周血单核细胞。使用T-SPOT.TB试剂盒(英国Oxford Immunotec Ltd公司)向包被有γ-干扰素抗体的96孔板中加入外周血单核细胞，每孔2.5×105个细胞，共4个孔。向4个孔内分别加入50 μL PHA(阳性对照孔)、ESAT-6(ESAT-6孔)、CFP-10(CFP-10孔)及细胞培养液(阴性对照孔)。然后置于37 ℃、含体积分数5%CO2细胞培养箱内孵育16～20 h，经磷酸盐缓冲液反复洗涤后加入γ-干扰素二抗孵育1 h，再次洗涤，每孔加入底物显色液反应7 min。使用斑点计数仪分别对4个孔的sfc进行计数。当阴性对照孔sfc数为0～5，ESAT-6孔或CFP-10孔sfc数大于阴性对照孔至少6个为阳性；当阴性对照孔sfc数≥6，ESAT-6孔或CFP-10孔sfc数不小于2倍的阴性对照孔为阳性；若阳性对照孔结果正常，但ESAT-6孔或CFP-10孔sfc数均未及上述阳性判定标准则为阴性。计算2组T-SPOT.TB结果阳性率，阳性率=阳性例数/总例数×100%。根据患者T-SPOT.TB结果中各孔sfc数，计算 CFP-10/PHA及ESAT-6/PHA，二者中的较大值为TBAg/PHA比值。

2 结果

2.1 2组患者T-SPOT.TB检测结果比较结果见表1。EPTB组和非EPTB组患者T-SPOT.TB检测结果阳性率分别为88.5%(185/209)和24.3%(76/313)；EPTB组患者T-SPOT.TB检测结果阳性率显著高于非EPTB组，差异有统计学意义(χ2=206.840，P<0.05)。EPTB组患者T-SPOT.TB检测结果中ESAT-6 sfc数、CFP-10 sfc数、TBAg/PHA比值显著高于非EPTB组，PHA sfc数显著低于非EPTB组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组患者T-SPOT.TB检测结果比较

2.2 ESAT-6 sfc数、CFP-10 sfc数及TBAg/PHA比值对EPTB的诊断价值结果见图1和表2。根据ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)，ESAT-6 sfc数、CFP-10 sfc数及TBAg/PHA比值对EPTB诊断截断点分别为16.00、20.00、0.20。TBAg/PHA比值诊断EPTB的特异度显著高于ESAT-6 sfc数和CFP-10 sfc数，差异有统计学意义(P<0.05)。ESAT-6 sfc数、CFP-10 sfc数及TBAg/PHA比值诊断EPTB的AUC和灵敏度比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A：ESAT-6 sfc数;B:CFP-10 sfc数;C:TBAg/PHA。

表2 ESAT-6 sfc数、CFP-10 sfc数及TBAg/PHA比值对EPTB的诊断价值

3 讨论

EPTB患者的发病部位较广泛，在淋巴结、脑膜、骨关节、消化系统、泌尿系统、皮肤黏膜、生殖系统等均可发生。目前，MTB培养阳性仍是诊断EPTB的金标准[1]，但由于标本较难获得且MTB培养耗时较长，限制了其在EPTB早期诊断中的应用[8]。而其他常用的MTB实验室检测方法如结核菌素试验、结核抗体检测、聚合酶链反应、GenexDen MTB/RIF检测，由于易受到卡介苗接种史、个体免疫状况、实验室条件影响以及标本获取困难、无法区别死菌和活菌等，导致其诊断EPTB的敏感度及特异度低[9-10]。因此，寻找高灵敏度和特异度并适合实验室应用的早期诊断EPTB的方法十分必要。

IGRA是利用TBAg刺激MTB感染相关的T淋巴细胞使其产生免疫应答，并通过测定T淋巴细胞产生的γ-干扰素水平，判断机体是否存在MTB感染的一种国际中常用的MTB感染诊断方法。因IGRA不受卡介苗及绝大多数非MTB感染的影响，已经被应用到结核病诊断的各个领域[11]。T-SPOT.TB作为IGRA较常用的检测方法在临床诊断中被广泛应用，然而随着T-SPOT.TB在临床诊断中的广泛应用，研究人员发现其在中低收入国家对于ATB的诊断并没有表现出明显优于结核菌素试验的性能[12]，且诊断灵敏度不足、假阳性率高，使其不适用于高负担结核病环境中ATB的诊断[13]。ZHOU等[11]对IGRA诊断EPTB的系统性综述和meta分析中也指出，EPTB确诊患者外周血T-SPOT.TB检测的综合灵敏度为82%，特异度为70%，提示T-SPOT.TB用于诊断EPTB的总体性能没有预期的高。本研究中虽然EPTB组ESAT-6 sfc数、CFP-10 sfc数均显著高于非EPTB组，但ROC曲线显示ESAT-6 sfc数、CFP-10 sfc数诊断EPTB的特异度不高，提示ESAT-6 sfc数、CFP-10 sfc数诊断EPTB的作用有限，这与 WANG等[14]的观点一致。诊断特异度不高直接影响到T-SPOT.TB在高结核潜伏感染率地区诊断EPTB的应用价值。

已有研究提出PHA sfc数能够反映患者的免疫抑制状态[9]，而ATB多发生于机体免疫功能下降时，且EPTB的发生可能是免疫抑制出现的标志[15]。本研究结果显示，EPTB组患者PHA sfc数显著低于非EPTB组。因此本研究利用TBAg/PHA比值来消除个体免疫差异对EPTB诊断结果所造成的影响，分析TBAg/PHA比值能否提高诊断EPTB的性能。

本研究结果显示，TBAg/PHA比值诊断EPTB的特异度显著高于ESAT-6 sfc数和CFP-10 sfc数，提示TBAg/PHA比值诊断EPTB的临床价值高于常规T-SPOT.TB检测方法。诊断EPTB特异度的提高可以排除大部分LTBI，提高诊断ATB的概率，因此TBAg/PHA比值降低了LTBI对T-SPOT.TB诊断EPTB的影响，对于高结核潜伏感染率国家，TBAg/PHA比值法在EPTB诊断中的应用前景可期。同时，TBAg/PHA比值法仅需在T-SPOT.TB检测基础上进行数值计算，无需与其他的检测方法、设备、仪器联合，操作简便。但本研究尚存在以下局限性：(1)本研究未包括18岁以下患者，针对TBAg/PHA比值在儿童EPTB中的作用并不清楚；(2)本研究为单中心研究，样本量有限，需要扩大样本量进一步验证。

综上所述，TBAg/PHA比值可显著提高T-SPOT.TB诊断EPTB的特异度，在我国诊断EPTB中具有较大的应用前景。在今后可扩大研究范围和样本量进行探究，进一步验证TBAg/PHA比值在临床EPTB诊断中的应用价值，以期能够将其作为T-SPOT.TB检测的另一个有效诊断指标。