肌腱再生工程中肌腱细胞增殖分化研究进展

王淑贤,宋振峰，武林威，任天宁，孙永琨，3

(1.新乡医学院基础医学院，河南 新乡 453003；2.新乡医学院三全学院，河南 新乡 453003；3.河南省医用组织再生重点实验室，河南 新乡 453003)

急性或慢性肌腱损伤如肌腱撕裂、肌腱炎、肌腱退行性疾病等，是导致运动员、体力劳动者以及老年群体残疾的主要原因之一[1-2]，会严重影响相关人群的正常工作与生活[3]。目前临床上多采用保守理疗、康复锻炼、肌腱缝合或肌腱移植等方法治疗肌腱病，在肌腱修复过程中，由于损伤后的肌腱组织再生能力弱，修复过程慢，会出现肌腱组织异常增生，并产生瘢痕和不同程度的肌腱粘连，使肌腱很难恢复到正常的机械力学状态，因此传统的治疗方法并不是最佳的解决方案[4-5]。肌腱同种异体移植具有引发免疫排斥或疾病传播的风险[6]。自体肌腱移植能够达到较好的治疗效果，但也存在很多不利的因素，如:(1)自体肌腱组织的供应来源有限；(2)自体肌腱组织采集的同时可能会导致新的损伤。因此，利用自体肌腱细胞体外构建再生肌腱逐渐成为新的研究热点。然而，肌腱细胞增殖慢，衰老快，在体外传代数次后可能逐渐失去增殖能力，在此背景下，肌腱再生工程中就需要寻找新的种子细胞。而如何构建促进肌腱细胞增殖分化的微环境、如何培养体外表型稳定的肌细胞，是研究肌腱损伤修复的关键点。本文就近年来肌腱再生工程中肌腱细胞增殖分化的研究进展进行分析，总结出在肌腱损伤修复过程中较理想的种子细胞、有效的细胞培养方式和促肌腱细胞增殖的微环境如生长因子、诱导剂、牵拉刺激等参与肌腱修复的因素，为肌腱细胞的稳定培养和扩增生长提供应用策略。

1 正常肌腱的结构和功能

肌腱是连接肌肉和骨骼之间的致密结缔组织。肌肉收缩可通过肌腱的牵引带动骨的运动。每块骨骼肌都分为肌腹和肌腱2个部分，肌腹由肌纤维构成，色红质软，有收缩能力；肌腱由致密结缔组织构成，色白较硬，没有收缩能力。肌腱细胞是肌腱的基本功能单位，占肌腱组织质量的5%，其合成和分泌胶原等细胞外基质，参与肌腱组织的新陈代谢，维持组织内的稳态。细胞外基质的主要成分是胶原蛋白(Ⅰ型胶原为主)、弹性蛋白和糖蛋白等[7]。鉴于此，肌腱细胞可通过免疫组织化学染色方法来鉴定，Ⅰ型胶原抗体染色呈阳性、Ⅲ型胶原抗体染色呈阴性者可确定为肌腱细胞。

2 肌腱损伤的发生和修复机制

肌腱损伤的发生机制目前尚未完全明确，主要有3种可能：(1)机械性过度使用。在持续重复活动的情况下,当肌腱所承受的机械负荷达到损伤阈值时，可发生微损伤，微损伤随着时间的推移而积累，使肌腱损伤的概率增加。(2)血管杂生。肌腱损伤引起的血管混杂内生，可造成血管损伤和局部组织缺氧，加重肌腱损伤和引发肌腱退化。(3)老化。老化可改变肌腱的机械性能和代谢过程,使老化状态下的肌腱更易发生退行性变和损伤[8]。另有研究表明，肌腱损伤后主要通过调控肌腱细胞及细胞外基质进行自我修复，即损伤肌腱通过细胞外基质的过度和无序沉积产生非正常再生的瘢痕组织，启动组织修复[9]，这一修复机制是相互依赖、相互重叠的3个阶段:炎症反应阶段、纤维母细胞增殖阶段、长时间的重建阶段[10-11]。以上研究提示，肌腱修复的机制与愈后纤维化肌腱的性能、肌腱细胞的数量、细胞外基质的成分密切相关，如何构建肌腱细胞生长所需的微环境是研究肌腱再生的关键。选取理想类型的干细胞进行培养，并在干细胞培养中增加力学微环境刺激，将会更有效地促进肌腱细胞的修复和再生。

3 肌腱再生工程中理想的种子细胞

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞(adult stem cell，ASC)是目前发现的两大类干细胞。受伦理道德的影响和对干细胞分化能力控制等方面的顾虑，目前各国对ESC的研究普遍持谨慎态度。ASC存在于机体的各类组织和器官中，取材和培养均较容易，且有伦理学优势，因此,在肌腱再生工程研究中，肌腱干细胞(tendon stem cells，TSCs)、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、脂肪源干细胞(adipogenic stem cells，ADSCs)等成体干细胞因其具有较成熟的修复损伤功能和无限的增殖潜能，成为目前较热衷研究的理想的种子细胞。

3.1 TSCs2007年美国学者从人和兔的肌腱中分离出一种具有自我更新能力的细胞，将其命名为TSCs[12]。国内学者从大鼠的跟腱中分离并鉴定了TSCs，用微组织块培养法获取了更多的TSCs[13]。另外，在组织工程化肌腱研究中发现，TSCs在生物相容性、结构稳定性方面比BMSCs更具优势[14]。相比其他间充质干细胞，TSCs具有容易识别的表面标记[15]。TSCs做为肌腱损伤修复过程的种子细胞，其潜力和前景是肯定的，但其分离培养和鉴别方法有待标准化。

3.2 BMSCsBMSCs是最常见和最有潜力的种子细胞，目前对于BMSCs用于成骨和成软骨的研究已较为成熟，但其向肌腱细胞分化的研究尚不成熟。在原代培养BMSCs过程中，常用的是全骨髓分离培养法，在体外进行分离和培养，BMSCs分化和增殖速度快，培养周期短，但由于缺乏完善的、标准化的分化方案，选择其作为理想的种子细胞仍具有挑战[16]。

3.3 ADSCsADSCs是来源于脂肪组织的成体干细胞，不仅在研究应用上有安全性和伦理学优势，而且具有肌源性分化的能力，即ADSCs在某些情况下易于分化为肌腱细胞，可以促进Ⅰ型胶原纤维的形成并改善肌腱修复过程中的机械性能。另外，ADSCs还具有易于提取和分离的特点，可从皮下脂肪组织取材获得，损伤相对较小。在体外培养过程中还发现，该细胞对营养的需求不高，有较强的细胞贴壁能力，在培养液中生长旺盛[17]。还有研究提示，ADSCs可以减缓肌腱炎疾病的发展进程，具有促进肌腱的解剖结构和生理功能恢复的潜能[18]。尤其在早期肌腱愈合中，ADSCs可以增加肌腱的极限拉伸负荷，提高在极限拉伸负荷下肌腱的伸长率，这表明ADSCs在生物力学方面的优势更明显[19]。还有学者证实，ADSCs可能具有抑制成纤维细胞过度增殖及促进胶原分泌的功能[20]；通过ADSCs培养也可获取外泌体用于肌腱损伤的治疗[21],同时，ADSCs具有的多能性和可塑性的特点也提示了其在肌腱组织修复中极具优势[22-23]。综合显示，ADSCs是更理想的种子干细胞，在肌腱组织再生中具有更广阔的应用前景。

4 肌腱再生工程中细胞的培养模式——共培养

间充质干细胞与不同类型细胞共培养可促进细胞增殖并诱导干细胞分化为不同的细胞系，如神经源性、肌源性、成骨细胞或软骨源性[24]。近年来，共培养模式被用于模拟体内微环境，诱导干细胞分化，将干细胞直接释放的因子通过旁分泌作用刺激细胞增殖[25]。另有研究提示，间接共培养模式能够诱导ADSCs在缺氧和高氧条件下高效分化为腱样细胞[26]，提示共培养模式下氧浓度与肌腱细胞再生并非完全正相关关系。从脂肪组织中分离并鉴定出脂肪间充质干细胞和肌腱细胞，在具有通透性的培养皿中体外共培养ADSCs和肌腱细胞，可研究共培养模式下肌腱细胞分泌的细胞因子对ADSCs向肌腱细胞分化的作用机制。

5 肌腱细胞增殖分化的微环境

在肌腱愈合过程中生长因子、牵拉刺激的参与和调节可增加肌腱细胞再生的数量，改善肌腱修复的张力[27]。因此可从细胞外基质、机械牵拉负荷2个方面同时进行干预，探索肌腱细胞增殖分化微环境中的变化机制，明确肌腱细胞、细胞外基质和机械负荷之间所涉及的信号通路以及相互影响和作用的方式。

5.1 生长因子生长因子是一种能够促进细胞生长和增殖的小分子多肽类物质，主要是通过自分泌或旁分泌的方式与细胞膜受体结合发挥局部作用。目前已知的参与肌腱修复过程的生长因子主要有转化生长因子(transforming growth fator，TGF)、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子等[28-31]，在人体发育和成年期间，体内分泌的生长因子如TGF可以促进肌腱组织中胶原的表达和合成[32]。也有研究报道，同时补充多种生长因子刺激肌腱生成较使用单一生长因子效果更显著[33]。这些结果均提示，不同生长因子协同使用促进了损伤肌腱再生[34]。

5.2 牵拉刺激肌腱是对牵拉刺激极为敏感的组织，因此，在肌腱修复过程中，需要在低负荷与超负荷的牵拉刺激区间保持平衡。有研究表明，机械力也与动物和人类肌腱中的Ⅰ型胶原蛋白合成有关，负荷增加导致肌腱中的胶原含量增加，而负荷减少导致胶原含量减少[35-36]。在动态拉伸下，肌腱细胞和血管细胞的结合促进了工程肌腱构建的腱分化，这可为促进肌腱分化和再生提供一种有效的策略[37-38]。此外，研究表明，干细胞与机械牵拉刺激相结合可以增强细胞再生，机械牵拉刺激显著促进ADSCs的增殖、黏附和迁移，抑制细胞凋亡，增加促愈合细胞因子的产生[39-40]。越来越多的证据表明，ADSCs可以通过直接再生和间接机械牵拉刺激促进组织修复[41-42]。

6 结语

综上所述，促进肌腱再生的种子细胞很多，其中ADSCs最易于取材和分离，还能增加肌腱的极限拉伸负荷，有助于恢复肌腱的牵拉性能。再生组织工程中的肌腱细胞治疗在促进肌腱重建和功能恢复方面有潜在的巨大应用前景，将生物工程策略转化为肌腱病治疗方案的过程中所面临的挑战问题是缺乏标准化的肌腱细胞培养方案以及特异性的肌腱细胞分子标记，这是未来肌腱再生细胞治疗研究领域亟待解决的问题。本文通过综述分析肌腱再生中种子细胞的选取及肌腱细胞增殖所需要的最适微环境，认为共培养模式下施加机械牵拉刺激而促使ADSCs向肌腱细胞增殖分化，可做为肌腱病修复治疗的新的研究思路和治疗方案；在确定理想的种子细胞后，将ADSCs与肌腱细胞共培养，并施加不同强度的二维或三维牵拉刺激，给予肌腱细胞增殖分化所需的微环境，如最适的氧浓度、促扩增的生长因子类型及有利的牵拉刺激强度等，有助于设计新的、有效的、有利于损伤肌腱再生的组织工程方法。