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亚胺培南异质性耐药大肠埃希菌血流感染流行病学及危险因素调查

2021-03-24何建春赵俊英裴昌贞

新乡医学院学报 2021年2期
关键词:青霉亚群引物

何建春,董 剑,杨 雷,赵俊英,裴昌贞

(1.重庆市大足区人民医院检验科,重庆 402360;2.重庆市大足区人民医院睡眠心身中心,重庆 402360)

亚胺培南(imipenem,IPM)是一种对产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)和/或AmpC β-内酰胺酶的大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)有强抗菌活性的非典型β-内酰胺抗生素,常用于血流感染等严重感染的治疗[1-2]。近年来,随着耐IPME.coli不断增多,耐碳青霉烯E.coli已严重影响临床用药。研究发现,一些菌株耐药性出现异质性表达,即异质性耐药[3](heteroresistance,HR)。HR是指同一菌株不同亚群对同一抗菌药物敏感性各不同的现象。HR表现为常规纸片扩散法(disk diffusion method,K-B)药敏实验抑菌圈内有数量不等的菌落生长。但微量肉汤稀释法测定HR菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)常把HR菌株误判为敏感,给临床药敏结果判断带来困扰,导致抗感染治疗失败和复发。HR现象多见于鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等[3-4],E.coli对碳青霉烯类抗生素的HR现象较少见。因此,本研究对IPM-HR-E.coli血流感染进行流行病学和危险因素调查,旨在为有效防治该类表型菌株的感染提供依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源选取2016年1月至2018年12月于重庆市大足区人民医院住院患者血液标本分离的非重复E.coli共163株。所有分离培养出E.coli的患者中男59例,女104例;年龄51~71(58.25±20.66)岁。病例纳入标准:血液标本首次培养出E.coli且病历资料齐全。病例排除标准:(1)血液标本培养阴性;(2)血液标本培养出E.coli但病历资料不全;(3) 血液标本培养出E.coli且对IPM耐药菌(n=5株)。将血液标本分离出IPM-HR-E.coli的患者设为病例组(n=65),分离出IPM敏感E.coli的患者设为对照组(n=93)。质控菌株为ATCC25922,购自卫生部临床检验中心。

1.2 主要试剂与仪器哥伦比亚血平板、巧克力平板购自郑州安图公司,MH平板购自重庆庞通医疗器械有限公司,K-B法药敏纸片购自英国Oxoid公司,Agarose B Low EEO、细胞裂解液CLB、蛋白酶K、溴化乙锭(ethidium bromide,EB)溶液购自生工生物工程(上海)股份有限公司,生理盐水购自重庆西南药业股份有限公司;BacT/Alert-120型全自动血培养仪及配套血培养瓶、Vitek2 Compact全自动细菌鉴定系统及配套药敏卡购自法国梅里埃公司,含体积分数5%CO2恒温培养箱购自上海力申科学仪器有限公司,伯乐电泳仪、伯乐凝胶成像仪购自美国BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 血标本分离培养及菌株鉴定所有送检的血液标本按照《全国临床检验操作规程(第4版)》进行操作和培养,并将血培养阳性标本进一步转种至哥伦比亚血平板中培养,将培养出的细菌使用Vitek2全自动细菌鉴定系统进行菌种鉴定。

1.3.2E.coli药敏实验使用Vitek2测定细菌对氨苄西林、庆大霉素、阿米卡星、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、美罗培南和亚胺培南等抗生素的MIC。ESBLs表型确认通过双纸片协同试验完成[5],具体方法:将Vitek2筛出的产ESBLs菌用头孢噻肟(30 μg)、头孢噻肟/克拉维酸(30 μg/10 μg)、头孢他啶(30 μg)和头孢他啶/克拉维酸(30 μg/10 μg)扩散,在其任何一种药敏纸片上加克拉维酸后与不加克拉维酸后的抑菌圈直径之差≥5 mm为产ESBLs。

1.3.3 K-B法初筛IPM-HR-E.coli表型采用K-B法对IPM-HR-E.coli表型进行初筛,具体操作和结果判读参照2019版CLSI M100-S29文件[6]:挑取适量E.coli比浊到0.5麦氏单位,在MH平板上均匀涂布后贴上IPM药敏纸片,于35 ℃下孵育16~18 h后观察。抑菌圈内有菌落生长判定为HR;反之,则判定为非异质性耐药。

1.3.4 菌落谱型分析(population analysis profile,PAP)确认IPM-HR-E.coli将K-B法初筛为HR的菌株进行PAP实验确认,具体步骤参照相关报道[4]:制备64.0 g·L-1IPM,并倍比稀释至0.25 g·L-1,配置成0.125~32.000 g·L-1抗生素平板,通过稀释法得到10-1~104cfu·L-1菌株,对应均匀涂布到抗生素平板上,35 ℃孵育,计算每个平板上生长的菌落数(n),再换算得到实际菌落数(N),N=n×10×稀释倍数,通过LogN换算,最后制作PAP图。PAP实验判断标准为:细菌在最高非抑菌抗生素浓度至最低完全抑菌抗生素浓度之间≥8倍,可证实为HR[3]。

1.3.5 脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分析IPM-HR-E.coli同源性使用PFGE[7]对Vitek2药敏筛选得到的MIC值相同/相似的IPM-HR-E.coli进行检测并分析:将3.5~4.0麦氏单位的IPM-HR-E.coli悬液通过Agarose B Low EEO制成菌棚胶,加入细胞裂解液CLB和蛋白酶K进行溶菌和裂解,超纯水清洗,然后进行酶切,琼脂糖电泳,加入EB溶液,置于成像仪上显色。PFGE判断标准[7]:(1)条带一样表示相同菌株;(2)相差2~3个条带表示密切相关;(3)相差4个条带以上表示不同菌株。

1.3.6 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测IPM-HR-E.coli耐药基因煮沸法提取病例组产ESBLs菌株DNA,PCR检测其耐药基因。反应体系中加入Tap酶、模板和引物,再进行扩增,PCR所需引物参考相关文献[8],ESBLs基因包括blaTEM(上游引物序列为5′-GTGCGCGGAACCCCTATT-3′,下游引物序列为5′-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3′)、blaSHV(上游引物序列为5′ - CTTTACTCGCCTTTATCGGC-3′,下游引物序列为5′ -TTACCGACCGGCATCTTTCC-3′)、blaCTX-M(上游引物序列为5′-CCCATGGTTAAAAAATCACTGC-3′,下游引物序列为5′-CAGCGCTTTTGCCGTCTAAG-3′)、Ⅰ 类整合子基因(上游引物序列为5′-GGTCAAGGATCTGGATTTCG-3′,下游引物序列为5′-ACATGCGTGTAAATCATCGTC-3′)、blaOmpF(上游引物序列为5′-AATATCATCACGTTCCTATGG-3′,下游引物序列为5′-GTGAGATTGCTCTGGAAG-3′)和blaOmpC(上游引物序列为5′-GACTT GCCGACTGATTAATGA-3′,下游引物序列为5′-CTGATGTTGTACGCTGAAAAC-3′),严格按照PCR操作步骤进行。

1.4 临床资料收集收集病例组和对照组患者年龄、肺部感染、腹腔感染、感染前手术史、机械通气、气管插管和抗生素使用情况等临床资料。

1.5 统计学处理采用SPSS19.0软件进行数据分析与处理。计数资料用例数和百分率表示,2组间比较采用χ2检验,计算比值比(odds ratio,OR)和95%置信区间(confidence interval,CI);P<0.05为差异有统计学意义。将2组间单因素分析中P≤0.10的变量采用logistic回归模型进行独立危险分析。

2 结果

2.1 IPM-HR-E.coli检出率及临床特征在所有标本中共检测到E.coli163株。K-B法初筛IPM-HR见图1,PAP实验对IPM-HR验证结果见图2。在163株E.coli中,IPM-HR菌株(病例组)共65株,占39.8%;IPM敏感菌株(对照组)93株,占57.1%;IPM耐药菌株5株,占3.1%。IPM-HR-E.coli菌株标本主要来源于泌尿外科15例(23.1%)、ICU 11例(16.9%)、肾内科9例(13.8%)、普外科8例(12.3%)和消化内科5例(7.7%)等。

图1 IPM-HR-E.coli菌株K-B法检验结果

图2 E.coli菌株IPM的PAP分析

2.2 IPM-HR-E.coli药敏实验结果病例组E.coli对氨苄西林、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、庆大霉素和阿米卡星的耐药率分别为96.9%(63/65)、61.5%(40/65)、69.2%(45/65)、27.7%(18/65)、21.5%(14/65)和10.8%(7/65);对照组E.coli对氨苄西林、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、庆大霉素和阿米卡星的耐药率分别为87.1%(81/93)、33.3%(31/93)、41.9%(39/93)、14.0%(13/93)、16.1%(15/93)和8.6%(8/93)。病例组E.coli对氨苄西林、头孢他啶、头孢曲松和头孢吡肟的耐药率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);病例组与对照组E.coli对庆大霉素和阿米卡星的耐药率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 IPM-HR-E.coli的PFGE分型结果见图3。21株IPM-HR-E.coli显示不同条带,无相同/相似条带,属于不同型别及不同来源,表明菌株间不存在克隆传播和暴发流行。

1~21为21株E.coli 对应编号,显示为21个不同型别。

2.4 IPM-HR-E.coli耐药基因PCR检测结果病例组65株IPM-HR-E.coli中31株为产ESBLs IPM-HR-E.coli,PCR检测结果显示,21株(67.7%)携带blaCTX-M,9株(29.0% )表达blaTEM,仅1株(3.2%)表达blaSHV;17株(54.8%)携带Ⅰ类整合子基因,31株菌株均含blaOmpF和blaOmpC,4株(12.9%)共表达blaCTX-M和blaTEM。

2.5 IPM-HR-E.coli感染的单因素分析结果见表1。入住ICU、尿路感染、感染前手术史、静脉置管、肠外营养、导尿管、产ESBLs、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素使用是IPM-HR-E.coli感染主要危险因素(P<0.05)。

表1 IPM-HR-E.coli血流感染的单因素分析

2.6 IPM-HR-E.coli感染多因素分析结果见表2。尿路感染、感染前手术史、碳青霉烯类抗生素使用和产ESBLs是IPM-HR-E.coli感染的独立危险因素。

表2 IPM-HR-E.coli血流感染的多因素分析

3 讨论

HR是细菌耐药进化中的一种中间过程[4]。HR菌落由少部分耐药亚群和绝大部分敏感亚群组成,在抗生素刺激下,各亚群间为达最佳生长状态而进行个体优化,不能适应的敏感亚群被杀死、淘汰,少部分耐药亚群能够适应该抗生素浓度则不断繁殖使耐药亚群比例不断增加,加上传统药敏不能及时检出,临床不能及时加以遏制,加速细菌从敏感到耐药的形成[9]。因此,及时有效检出IPM-HR-E.coli,并找出其发生的危险因素具有重要的临床意义。

本研究结果显示,血流感染患者IPM-HR-E.coli检出率较高,达39.8%,高于国外相关报道[10],其原因可能是头孢类抗生素和碳青霉烯类抗生素不合理使用导致极少部分细菌亚群在抗生素压力下发生自发突变,而形成HR。IPM-HR-E.coli标本主要来自外科,特别是泌尿外科,可能与临床外科有术前预防性抗感染治疗及导尿管等侵入性操作有关。31株产ESBLs IPM-HR-E.coli中,67.7%携带CTX-M基因,54.8%携带Ⅰ类整合子基因。有文献报道,CTX-M型是我国E.coli中最常见的ESBLs基因型[11]。产ESBLs合并膜孔蛋白缺失/表达下调可能是碳青霉烯耐药的机制之一,Ⅰ类整合子基因可整合相应耐药基因,参与多重耐药基因水平传播,引起耐药[8]。因此,碳青霉烯异质性耐药机制与碳青霉烯耐药机制是否相同以及CTX-M基因是否参与引起IPM-HR发生有待进一步深入研究。PFGE是一种细菌生物学分型金标准[12]。本研究菌株PFGE检测结果显示,HR菌株条带均不相同,表明这些菌株不同源及不存在流行爆发情况。

本研究结果显示,有手术史和尿路感染是IPM-HR-E.coli血流感染的独立危险因素,这与标本主要来源于外科相吻合。推测其可能原因为E.coli是外科手术伤口感染的常见细菌[13],大部分患者在手术前后会接受一系列相关侵入性操作而引起机体损伤,细菌由伤口侵入机体,导致局部组织及血流发生感染。本研究病例组中尿路感染患者高于对照组,且这些患者最常见于泌尿外科,推测当患者发生尿石症、肿瘤和尿道先天畸形等泌尿系统疾病时,患者免疫功能低下、防御功能减弱,E.coli更容易入侵、定居繁殖而导致尿路感染[13]。导尿等操作可引起尿路系统机械性损伤,破坏尿道屏障功能,从而引起尿液中定植E.coli发生上行感染而入血[14]。因此,建议外科手术中应严格无菌操作,加强护理,减少尿路感染发生,防止IPM-HR-E.coli血流感染。研究表明,菌株在抗生素压力下,同一克隆菌可分为快生长和慢生长2个亚群,慢生长细菌可促进耐药基因表达而降解周围抗生素,为快生长群创造生存条件,从而形成HR[15]。本研究结果显示,碳青霉烯抗生素用药史是IPM-HR-E.coli血流感染发生的独立危险因素,与代佳伶等[16]研究结果相似。此外,本研究结果显示,产ESBLs也是IPM-HR-E.coli血流感染的独立危险因素。研究认为,ESBLs 基因能通过质粒水平传播,可由耐药亚群传递给敏感亚群,从而引起菌株HR[17]。因此,产ESBLs可能是IPM-HR-E.coli血流感染危险因素中最重要的一个内因。

综述所述,血流感染患者IPM-HR-E.coli检出率较高,手术史、尿路感染、碳青霉烯类抗生素使用和产ESBLs是IPM-HR-E.coli血流感染的独立危险因素。因此,建议加大对HR的关注,并制定相关预防措施,减少侵入性操作,合理使用抗生素,从而减少IPM-HR-E.coli血流感染的发生。

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