内质网应激对肝癌细胞硼替佐米耐药性的影响

闫登科，陶 丽，郝 洁，黄瑞娜，钟加滕

(1.平顶山第一人民医院消化内二科，河南 平顶山 467000；2.郑州大学附属肿瘤医院消化内科，河南 郑州 450000；3.新乡医学院第一附属医院感染疾病科，河南 卫辉 453100；4.新乡医学院基础医学院病理学教研室，河南 新乡453003)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，严重危害人们的身体健康，目前，HCC发病率和病死率呈上升趋势，其主要治疗手段为手术治疗、放射治疗和化学治疗。随着化学治疗药物的广泛应用，HCC对药物呈现出明显的耐受，新的治疗方案和联合用药策略的提出迫在眉睫。细胞内泛素蛋白酶体降解途径的异常与肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关。基于此，研究者开发了多种靶向蛋白酶体的药物，其中对硼替佐米的研究最为广泛，其也是第1个应用于临床研究的蛋白酶体抑制剂。目前临床上硼替佐米主要应用于治疗难治性、多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤，其对肝癌细胞生物学行为的影响以及可能的作用机制尚不清楚。内质网是一个动态、特化、拉长的膜状网络小管和扁平圆盘，其以囊状连接横跨细胞质的大部分区域和分支管[1]。内质网参与细胞的多种生物学过程，包括生物合成和维持细胞内Ca2+稳态等[1]。同时，内质网可以与细胞内其他细胞器协调作用，感知细胞内外各种因子的作用，维持细胞内稳态[2-3]。研究显示，内质网调控着细胞内蛋白质的折叠与加工，包括加速适当的蛋白质折叠、未折叠蛋白反应的激活和通过内质网相关降解或自噬的蛋白质清除过程[4]，当出现大量的错误折叠或未折叠蛋白在内质网内聚集会导致内质网应激[5]。近年来研究显示，内质网应激在肿瘤的发生和发展过程中发挥了重要作用，特别是在抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程中[6-7]。内质网应激往往在癌症的发生和发展过程中发挥着双向调控作用，既可以引起内质网应激保护机制，也可以通过内质网应激相关凋亡信号通路诱导细胞凋亡的发生[8]。本研究将内质网应激引入硼替佐米的作用机制研究中，通过体外实验明确靶向内质网应激对肝癌细胞的硼替佐米耐受性的影响，为临床克服肿瘤耐药和寻找可能的联合用药策略提供一定的方向和理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、仪器与试剂人肝癌HepG2和HuH7细胞购自中国科学院细胞库；细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司，细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)购自南京碧云天生物试剂有限公司，Western blot电泳套装购自美国Bio-Rad公司；胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)购自美国Gibco公司，硼替佐米、内质网抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)和牛磺脱氧胆酸(taurourso-deoxycholic acid,TUDCA)购自美国MCE公司，切割片段的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase，cleaved caspase-3)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、磷酸化真核翻译起始因子2α(phosphorylated eukaryotic initiation factor-2α,p-eIF-2α)、激活转录因子4 (activating transcription factor 4,ATF4)、Tubulin抗体购自美国CST公司。

1.2 细胞培养取HepG2和HuH7细胞加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、含体积分数5%CO2细胞培养箱内培养，细胞生长至铺满细胞培养瓶底部面积的80%时利用胰蛋白酶消化后传代，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 CCK-8检测HepG2和HuH7细胞的存活率及增殖率取对数生长期HepG2和HuH7细胞，弃除原培养液后应用胰蛋白酶消化处理，细胞吹匀后进行细胞计数，将细胞接种于96孔板(细胞存活率检测按照每孔1.2×104个细胞，细胞增殖率检测按照每孔5.0×103个细胞)，铺板混匀后培养过夜，第2天细胞完全贴壁后进行实验。细胞存活率检测实验将细胞分为0、5、10、15、20、30 nmol·L-1硼替佐米组，检测药物干预24 h时细胞存活率；细胞增殖率检测实验将细胞分为0、5 nmol·L-1硼替佐米组，检测药物干预0.24、48、72、96 h时细胞增殖率；药物作用完成后，在避光条件下每孔加入10 μL CCK-8试剂，加入液面以下，轻轻拍打培养板侧壁，混匀CCK-8，置于37 ℃孵育箱中孵育30 min后取出96孔板，使用酶联免疫检测仪检测波长450 nm处各孔吸光度值，每组设6个重复孔，取均值。

1.4 Western blot检测HepG2和HuH7细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达取对数生长期HepG2和HuH7细胞，将细胞随机分为0、10、15 nmol·L-1硼替佐米组；药物作用完成后磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗细胞2次，每组给予300 μL 放射免疫沉淀试验细胞裂解液(含体积分数1% 苯甲基磺酰氟、150蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂)冰上裂解5 min。使用细胞刮刮下培养皿内全部细胞，移至提前预冷的EP管中，冰上再次裂解20 min。将EP管放入离心机，12 000 r·min-1离心15 min，离心后吸取上清进行蛋白浓度测定(二喹啉甲酸法)。根据蛋白浓度计算上样体积，蛋白中加入加样缓冲液，95 ℃煮蛋白10 min使其变性后进行丙烯酰胺垂直电泳，电泳结束后将胶上的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上，转膜结束放入50 g·L-1脱脂奶粉中封闭1 h，加入一抗，室温孵育30 min后4 ℃低温孵育过夜，第2天应用含Tween-20的PBS洗膜3次，加入二抗，温孵育1 h，应用含Tween-20的PBS洗膜3次，发光显色，拍照，应用Image J软件分析条带灰度值。

1.5 硼替佐米耐药的HepG2细胞株构建取生长状态优良的对数生长期HepG2细胞，加入2 mL PBS缓慢清洗2遍，加入1 mL胰蛋白酶进行消化，消化完全后加入4 mL DMEM培养液中和，混匀，移至离心管内，2 000 r·min-1离心2 min，移除上清液，加入适当的培养液制成细胞悬液，首先加入浓度为5 nmol·L-1的硼替佐米，连续作用 48 h，移除含有硼替佐米的培养液，加入不含药物的培养液培养，细胞长至铺满皿面积的90%时进行消化传代，再次加入含有硼替佐米的培养液，药物浓度先后使用 10、50、100、500、1 000 nmol·L-1与HepG2细胞共培养，HepG2从5 nmol·L-1逐渐增加到1 000 nmol·L-1，从而建立抗硼替佐米细胞，命名为HepG2/Bort。为了排除选择性硼替佐米浓度的干扰，在实验开始前，将耐硼替佐米细胞在无硼替佐米培养基中培养至少72 h。细胞耐药后，进入下一浓度筛选，最后使HepG2细胞能够耐受1 000 nmol·L-1。采用CCK8实验，通过抑制生长曲线计算细胞的半抑制浓度(50% inhibiting concentration,IC50)，并计算细胞耐药指数(resistance index,RI)。RI=HepG2细胞IC50/HepG2/Bort细胞IC50。

1.6 CCK-8法和Western blot法检测HepG2/Bort细胞存活率和内质网应激相关蛋白的表达将HepG2/Bort细胞分为对照组、硼替佐米组(给予15 nmol·L-1硼替佐米干预)、硼替佐米+4-PBA组(给予15 nmol·L-1硼替佐米和8 mmol·L-14-PBA干预)、硼替佐米+TUDCA组(给予15 nmol·L-1硼替佐米和1 mmol·L-1TUDCA干预)，药物作用24 h后，应用CCK-8法检测HepG2/Bort细胞存活率，采用Western blot法检测HepG2/Bort细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和内质网应激相关蛋白GRP78、p-eIF-2α、ATF4的表达。

2 结果

2.1 硼替佐米对肝癌细胞存活率的影响结果见表1。硼替佐米干预24 h后，5、10、15、20、30 nmol·L-1硼替佐米组HepG2和HuH7细胞存活率均显著低于0 nmol·L-1硼替佐米组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 硼替佐米对肝癌细胞存活率的影响

2.2 硼替佐米对肝癌细胞增殖率的影响结果见表2和表3。硼替佐米干预0、24 h时，5 nmol·L-1硼替佐米组与0 nmol·L-1硼替佐米组HepG2和HuH7细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)；硼替佐米干预48、72、96 h时，5 nmol·L-1硼替佐米组HepG2和HuH7细胞增殖率显著低于0 nmol·L-1硼替佐米组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 硼替佐米对HepG2细胞增殖率的影响

表3 硼替佐米对HuH7细胞增殖率的影响

2.3 硼替佐米对肝癌细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达的影响结果见图1、图2和表4。10、15 nmol·L-1硼替佐米组HepG2和HuH7细胞中cleaved caspase-3表达显著高于0 nmol·L-1硼替佐米组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 3组HepG2和HuH7细胞中cleaved caspase-3表达比较

2.4 HepG2细胞和HepG2/Bort耐药细胞对Bortezomib的IC50HepG2/Bort细胞和HepG2细胞对硼替佐米的IC50分别为122.36、13.23 nmol·L-1，HepG2/Bort细胞对硼替佐米的RI为9.25。

2.5 硼替佐米对内质网应激相关蛋白表达的影响结果见图3和表5。HepG2/Bort细胞中GRP78、p-eIF-2α、ATF4蛋白表达显著高于HepG2细胞，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图3 HepG2细胞和HepG2/Bort细胞中质网应激相关蛋白表达(Western blot)

表5 HepG2细胞和HepG2/Bort细胞中内质网应激相关蛋白表达比较

2.6 抑制内质网应激对HepG2/Bort细胞药物敏感性的影响对照组、硼替佐米组、硼替佐米+4-PBA组、硼替佐米+TUDCA组HepG2/Bort细胞存活率分别为1.201±0.085、1.076±0.055、0.723±0.045、0.570±0.062；硼替佐米组HepG2/Bort细胞存活率显著低于对照组，硼替佐米+4-PBA组和硼替佐米+TUDCA组HepG2/Bort细胞存活率显著低于硼替佐米组，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、硼替佐米组、硼替佐米+4-PBA组、硼替佐米+TUDCA组HepG2/Bort细胞内cleaved caspase-3相对表达量分别为0.074±0.026、0.105±0.041、0.457±0.112、0.862±0.176；硼替佐米组HepG2/Bort细胞内cleaved caspase-3相对表达量显著高于对照组，硼替佐米+4-PBA组和硼替佐米+TUDCA组HepG2/Bort细胞内cleaved caspase-3相对表达量显著高于硼替佐米组，差异均有统计学意义(P<0.05)；见图4。

1：对照组；2：硼替佐米组；3：硼替佐米+4-PBA组；4：硼替佐米+TUDCA组。

3 讨论

肝癌是世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤，在我国，肝癌发病率在所有恶性肿瘤中居第4位；目前，肝癌的治疗方法仍然以手术治疗、放射治疗和化学治疗为主，患者5 a生存率低于12%[9]。研究显示，HCC由于先天性或后天性耐药的出现，常用的化学治疗药物对患者生存率的改善效果不明显[10]。因此，寻找新的治疗靶点和联合用药策略，提高抗肿瘤药物的敏感性成为克服耐药和改善患者生存率的关键。

硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，2003年获得美国食品药品监督管理局批准，是目前唯一被批准应用于临床的蛋白酶体抑制剂，主要用于治疗难治性多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤[11]。蛋白酶体活性抑制被认为是硼替佐米的典型功能，是治疗难治性多发性骨髓瘤的主要作用机制[12]。硼替佐米干扰26S蛋白酶体，通过增强凋亡相关蛋白caspase的表达促进细胞凋亡的发生[13]。目前，硼替佐米对肝癌细胞的影响尚不完全明确。本研究结果显示，硼替佐米可以显著降低肝癌HepG2和HuH7细胞的存活率和增殖率，诱导肝癌细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达升高，提高细胞内caspase-3酶活性；提示硼替佐米可以抑制肝癌细胞的生长、增殖，并促进肝癌细胞凋亡。为明确肝癌细胞对硼替佐米耐药的可能机制，本研究建立了对硼替佐米耐药的HepG2细胞株，即HepG2/Bort细胞，结果显示，HepG2/Bort和HepG2细胞的IC50分别为122.36、13.23 nmol·L-1，HepG2/Bort细胞对硼替佐米的RI为9.25。有研究显示，内质网应激可能参与肿瘤细胞的耐药机制[14]。细胞在生长过程中面临各种应激的发生，内质网应激是其中常见的一种类型。细胞发生内质网应激时通过诱导未折叠蛋白反应来平衡应激作用。当未折叠蛋白反应达到临界阈值时，内质网应激相关伴侣分子GRP78与传感器分离，被激活的蛋白激酶RNA样内质网激酶通过磷酸化真核翻译起始因子2α亚基的 Ser51降低其翻译。p-eIF-2α会暂时抑制整体蛋白的翻译，以最大程度地降低内质网中的蛋白质折叠负荷，同时p-eIF-2α会在其包含较短的上游开放阅读框的5′非翻译区中选定 mRNA优先翻译。ATF4是翻译上调的蛋白之一，ATF4激活旨在缓解内质激素应激的基因表达。ATF4 有助于细胞稳态的多个方面，包括氨基酸生物合成和抗氧化剂程序[15]。本研究结果显示，HepG2/Bort细胞中内质网应激相关蛋白GRP78、p-eIF-2α、ATF4的表达显著高于HepG2细胞，而内质网抑制剂4-PBA和TUDCA可以显著降低HepG2/Bort细胞存活率，并诱导细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达增加；提示抑制内质网应激可以提高HepG2/Bort细胞对硼替佐米的敏感性。

综上所述，硼替佐米可以抑制肝癌细胞增殖，并诱导其凋亡；对硼替佐米耐受的HepG2细胞中内质网应激水平明显升高，抑制内质网应激可以明显提高对硼替佐米耐受的HepG2细胞的药物敏感性。本研究为临床克服肝癌耐药性提供了新的方向，也为临床联合用药提供了理论依据。