3种检测布鲁氏菌荧光定量PCR方法的比较

董 浩，原 霖，赵明海，许中衎，刘 巍，徐 阳，陈亚娜，梁春南*

3种检测布鲁氏菌荧光定量PCR方法的比较

董 浩1, 2，原 霖2，赵明海1，许中衎1，刘 巍1，徐 阳2，陈亚娜2，梁春南1*

(1. 中国食品药品检定研究院，北京 102629；2. 中国动物疫病预防控制中心，北京 102618)

为了筛选适用于家畜布鲁氏菌病检测的荧光定量PCR方法，合成目前报道最多的布鲁氏菌插入序列、基因和基因的引物和探针，并分别对这3种荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、重复性以及63份临床样品检测效果进行比较。结果显示：3种荧光定量PCR方法均具有较好的敏感性且均不与其他常见细菌发生交叉反应；3种方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5%。在检测临床样品时，3种方法的敏感性均高于套式PCR方法，其中IS711荧光定量PCR方法与套式PCR方法符合率为95.24%，其他2种方法与套式PCR方法的符合率为98.41%。比较而言，IS711荧光定量PCR敏感性最高，更适合于布鲁氏菌核酸含量低的样品的检测。

布鲁氏菌；荧光定量PCR；方法比对；插入序列

布鲁氏菌病（简称布病）是由感染布鲁氏菌引起的一种危害严重的人兽共患病。布鲁氏菌主要侵害患病动物的生殖系统，以母畜发生流产和公畜睾丸炎为主要特征。人感染布病以发热、乏力、流产、睾丸炎等为主要症状，严重影响患者的生活质量，甚至丧失劳动能力和生育能力。布病感染人类时，需要及时进行抗生素治疗，若治疗不及时则容易转变成慢性感染。

目前，全球共有超过170个国家报道有人或家畜布病的发生。根据相关报道，全球每年人类新发布病病例数超过50万人，在布病高发的中东地区，每百万人的发病数字超过200，但是世界卫生组织（WHO）的报告指出，真实的人间发病率应该为报告数字的10 ～ 25倍[1-2]。

由于接触患病动物或被污染的动物产品是人感染布病的主要途径，畜间布病的流行情况与人间布病的发生直接相关。根据现行的动物布鲁氏菌病诊断国家标准（GB/T18646—2018），家畜布病的检测方法中血清学方法应用最为广泛，包括虎红平板凝集试验、试管凝集试验、酶联免疫吸附试验、乳环试验和补体结合试验等。细菌分离试验是布病诊断的“金标准”，但是该方法分离率低、耗时费力且存在较大的生物安全风险。在现行国家标准中分子诊断方法，只推荐了Bruce-Ladder PCR方法，该方法属于多重PCR，可以用于布鲁氏菌进行分型，但是该方法敏感性较低，只能对经过分离培养的布鲁氏菌核酸进行检测，不能用于临床样品的直接检测。随着荧光定量PCR技术的发展，该技术已经应用于越来越多种动物疫病的诊断。布鲁氏菌病的荧光定量PCR方法也有较多的报道，其中报道最多的是针对(DegT/DnrJ/EryC1/StrS aminotransferase)、(Transposase, IS4)和(cell surface 31 kDa protein)这3个基因的荧光定量PCR方法[3-4]。本研究对上述3种荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性以及临床样品检测效果进行了评价，以期筛选一种合适于实验室布鲁氏菌核酸检测的荧光定量PCR方法，为家畜布病的分子检测提供一种有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 布鲁氏菌病S2疫苗株购自天康生物股份有限公司；大肠杆菌(CVCC4251)、鼠伤寒沙门氏菌(CVCC2220)、金黄色葡萄球菌(CVCC4098)、小肠结肠炎耶尔森菌(ATCC 23715)和乳酸杆菌(ATCC4356)均由本实验室保存。免疫羊的全血和阴道拭子样品采自河南省某羊场。

1.1.2 主要试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒，购自西安天隆科技有限公司；GoTag Probe qPCR Master Mix，购自Promega公司；TE缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Omega公司；H I、I和R I限制性内切酶以及T4连接酶购自NEB公司。

1.1.3 引物和探针 套式PCR引物、荧光定量PCR所有引物探针和构建载体的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本研究中所应用的引物和探针序列如表1所示。

表1 引物和探针序列

1.1.4 仪器 GeneRotex全自动旋转式核酸提取仪购自西安天隆科技有限公司；ABI7500荧光定量PCR仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA的提取 在生物安全柜中将S2疫苗株按说明书使用生理盐水稀释后，取出500 µL菌液分装至1.5 mL离心管，在80 ℃水浴锅中灭活2 h，使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行布鲁氏菌基因组DNA的提取。

将大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌和乳酸杆菌培养至稳定期，采用热灭活的方式将细菌灭活后，取1 mL培养物，10 000 r·min-1离心1 min后，吸取上清即为制备的核酸样品。

在生物安全柜中打开装有免疫羊的抗凝血样品、阴道拭子样品的抗凝采血管或离心管，分别取250 µL样品溶液加入装有20 µL蛋白酶K的无菌EP管中，颠倒混匀。放入56 ℃水浴锅中作用30 min后，将全部溶液组分加入预分装的基因组DNA提取试剂中。使GeneRotex全自动旋转式核酸提取仪进行提取。

1.2.2 反应体系与反应条件 荧光定量PCR的反应体系为20 µL，包括GoTag Probe qPCR Master Mix 10 µL，10 µmol·L-1的上游引物和10 µmol·L-1的下游引物各0.6 µL，10 µmol·L-1的探针0.6 µL，DNA模板2 µL，加入ddH2O 20 µL。反应条件为95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 40个循环。在每个循环第二步收集荧光信号。

1.2.3 对照质粒的构建 以疫苗株S2的核酸为模板，分别使用插入序列、基因和基因的载体构建引物进行目的片段的PCR扩增。回收大小正确的PCR扩增产物，同时提取pUC19质粒。使用H I和I限制性内切酶对基因和基因扩增产物以及pUC19质粒同时进行双酶切，回收酶切产物后使用T4连接酶进行连接，连接产物转化感受态细胞，通过Amp抗性和PCR反应鉴定阳性克隆，阳性克隆送公司使用M13F和M13R通用引物测序。构建成功的质粒分别命名为pUC-和pUC-。pUC-对照质粒的构建方法与上述过程类似，区别是使用H I和R I限制性内切酶对基因扩增产物以及pUC19质粒同时进行双酶切。

1.2.4 敏感性比较 将猪种布鲁氏菌S2疫苗株的基因组DNA使用TE溶液进行10倍系列稀释，依次稀释101～107倍。分别使用per、IS711和bcsp31等3种荧光定量PCR方法对上述系列稀释的基因组DNA样品进行扩增。

1.2.5 特异性比较 使用per、IS711和bcsp31等3种荧光定量PCR方法对猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA、热灭活的大肠杆菌、热灭活的鼠伤寒沙门氏菌、热灭活金黄色葡萄球菌、灭活的小肠结肠炎耶尔森菌和灭活的乳酸杆菌进行检测。

1.2.6 重复性比较 将猪种布鲁氏菌S2疫苗株的基因组DNA使用TE溶液进行10倍系列稀释，制备成100、101、102、103和104倍稀释样品。分别使用per、IS711和bcsp31等3种荧光定量PCR方法对上述系列稀释的基因组DNA样品进行扩增。批内重复性比较，每个样品同时进行3次重复。在不同时间对上述试验进行重复3次，以观察3种方法的批间重复性。

1.2.7 临床样品检测比较 对临床收集的63份免疫羊的抗凝血和阴道拭子样品，分别使用3种荧光定量PCR方法和《奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术》（NY/T 1467—2007）中规定的套式PCR方法进行检测，计算3种荧光定量PCR方法和现行行业标准中套式PCR方法的符合率。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pUC-per、pUC-IS711和pUC-bcsp31的构建

以猪种布鲁氏菌S2疫苗株的基因组DNA为模板，分别设计针对、和基因的扩增引物，引物序列如表1所示。使用PCR扩增上述3个片段，经过双酶切后插入pUC19载体中，获得重组质粒pUC-、pUC-1和pUC-。重组质粒构建完成后使用M13F和M13R通用引物测序。结果显示，pUC-、pUC-和pUC-阳性质粒的PCR产物的长度分别为360、493和408 bp。将测序结果与NCBI数据库中收录的布鲁氏菌菌株序列进行比对，一致性均为100%。

2.2 标准曲线的绘制

分别提取pUC-、pUC-和pUC-阳性质粒，使用TE缓冲液进行10倍系列稀释，每种阳性质粒稀释5个梯度。分别使用3种荧光定量PCR方法对相应的系列稀释的质粒溶液进行扩增，从而绘制各个方法的标准曲线。结果显示，per、IS711和bcsp313种荧光定量PCR方法的R2值依次为0.997、0.994和0.990，3种方法的扩增效率依次为99.19%、94.09%和112.15%（图1）。结果表明这3种荧光定量PCR的扩增效率均比较高，线性良好。

2.3 敏感性比较

使用TE缓冲液将猪种布鲁氏菌S2疫苗株的基因组DNA进行10倍系列稀释，分别使用per、IS711和bcsp31等3种荧光定量PCR方法对系列稀释的基因组DNA样品进行扩增。3种方法对不同稀释度样品的荧光定量检测结果如表2所示。使用IS711的荧光定量PCR方法可以检测到105倍稀释的猪种布鲁氏菌S2疫苗株的核酸，而per和bcsp31荧光定量PCR方法只能检测到104倍稀释的猪种布鲁氏菌S2疫苗株的核酸。以上结果说明IS711荧光定量PCR方法的敏感性高于其他两种方法。

A．per荧光定量PCR方法的标准曲线；B．IS711荧光定量PCR方法的标准曲线；C．bcsp31荧光定量PCR方法的标准曲线。

Figure 1 The standard curves using the three RT-PCR methods

表2 3种荧光定量PCR方法的敏感性比较结果（Ct值）

表3 3种荧光定量PCR方法的批内重复性结果

表4 3种荧光定量PCR方法的批间重复性结果

表5 3种荧光定量PCR和套式PCR检测临床样品的结果

2.4 特异性比较

分别使用per、IS711和bcsp31 3种荧光定量PCR方法对猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球、小肠结肠炎耶尔森菌、乳酸杆菌等基因组DNA进行检测，结果表明3种荧光定量PCR方法均只能够对猪种布鲁氏菌S2疫苗株核酸进行扩增，说明3种荧光定量PCR方法均具有良好的特异性。

2.5 重复性比较

分别对per、IS711和bcsp31 3种荧光定量PCR方法的批内和批间重复性进行比较。结果显示，per、IS711和bcsp31 3种荧光定量PCR方法的批内变异系数分别为：1.12%～2.59%、1.73%～2.79%和1.37%～ 2.36%（表3）。per、IS711和bcsp31 3种荧光定量PCR方法的批间变异系数分别为：2.03%～ 3.33%、1.95% ～ 3.28%和2.21% ～ 3.37%（表4）。上述3种荧光定量PCR方法的批内重复性和批间重复性的变异系数均小于5.00%，说明这3种方法的重复性良好。

2.6 临床样品检测结果的比较

使用3种荧光定量PCR方法和《奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术》中规定的套式PCR方法分别对63份免疫羊的抗凝血和阴道拭子样品进行检测。结果（表5）显示，套式PCR、per和bcsp31荧光定量PCR均检测到相同的9份阳性样品，而IS711荧光定量PCR除了检测到上述9份阳性样品，还多检测出3份免疫羊的抗凝血样品。通过计算符合率，per和bcsp31荧光定量PCR方法与套式PCR方法的符合率为98.41%，IS711荧光定量PCR方法与套式PCR方法的符合率为95.24%。

3 讨论与结论

在家畜布病诊断方法中，血清学方法应用最为广泛。但是大肠杆菌O:157和耶尔森菌O:9等细菌与布鲁氏菌存在血清学交叉反应，而且目前血清学方法均无法区分布病自然感染产生的抗体和疫苗免疫产生的抗体[5]。除此之外，对于特定动物（如乳用动物、种公畜等）进行血液样品采集时，可能还会影响生产性能，或者存在一定的危险性。上述这些原因使得家畜布病血清学检测方法的使用存在一定的局限性，也亟需其他类型检测方法作为补充手段。

随着荧光定量PCR技术的发展，以其高敏感性、高特异性和操作便捷的优点在病原诊断中得到了广泛的应用。相关报道表明，感染布病的家畜尿液、粪便、阴道分泌物、流产物、乳汁及精液中均可能检测到布鲁氏菌的存在[6]。其中，阴道分泌物、流产胎儿和乳汁中含菌量较大，可以直接进行细菌分离。相对于细菌分离培养的耗时费力、分离率低、生物安全风险大而言，通过荧光定量PCR方法直接检测样品中的核酸，能够快速、高效地检测布鲁氏菌，并且生物安全风险显著降低。同时由于荧光定量PCR方法具有极高的敏感性，可以通过定期对大罐奶混合样品、冻精样品等进行检测，可作为一种有效的动物群体布病监测方法[7-8]。

在本研究中，为了筛选一种适用的荧光定量PCR检测方法，对现在研究最多的per、IS711和bcsp31 3种荧光定量PCR进行了敏感性、特异性、重复性和临床样品检测效果的比较。绘制标准曲线表明3种方法均具有良好的线性和扩增效率。敏感性方面，IS711荧光定量PCR方法要高于其他2种荧光定量PCR方法，这与IS711插入序列在布鲁氏菌基因组中具有多个拷贝密切相关。在特异性方面，3种方法均不与常见的几种细菌发生交叉反应。在重复性方面，3种方法的批内和批间重复性均比较好。在进行临床样品检测时，和现行的奶牛布病检测行业标准中规定的套式PCR相比，IS711荧光定量PCR方法多检测了3份样品，per和bcsp31荧光定量PCR均多检测了1份样品。这说明这3种荧光定量PCR方法均比现行布病诊断标准中套式PCR检测方法更加敏感。鉴于荧光定量PCR方法比套式PCR和“金标准”细菌分离更加敏感，荧光定量方法比套式PCR方法多检测出的临床样品是否为真正的核酸阳性则需要更加敏感的定量方法进行确定，例如数字PCR方法[9]。

综上，3种荧光定量PCR方法均具有扩增效率高、线性好、敏感性高、特异性高和重复性好等特性，均适用于家畜布病临床样品的检测。比较而言，IS711荧光定量PCR方法敏感性更加优异。与常规PCR方法相比操作简单，荧光定量PCR方法不需要通过电泳来判定结果，不易造成气溶胶污染。因此，荧光定量PCR方法可以作为一种家畜布病检测的重要技术手段。同时为将我国家畜布病诊断标准与世界动物卫生组织（OIE）接轨，可考虑尽快将荧光定量PCR方法纳入家畜布病诊断的相关标准中，提升实验室布病检测能力。

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Comparison of three real time PCR assays for

DONG Hao1, 2, YUAN Lin2, ZHAO Minghai1, XU Zhongkan1, LIU Wei1, XU Yang2, CHEN Yana2, LIANG Chunnan1

(1. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629; 2. China Animal Disease Control Center, Beijing 102618)

To select a real time PCR method for the detection of animal brucellosis, the primers and probes of three real time PCR methods (insertion sequence,gene andgene), which were most reported, were synthesized. The sensitivity, specificity and repeatability of the three methods were tested. In addition, 63 clinical samples were also tested using the three real time PCR methods. The results indicated that the three real time PCR methods had good sensitivity and did not cross-react with the DNA samples from other common bacteria. Both intra-batch coefficient of variation and inter-batch coefficient of variation of the three methods were less than 5%. When testing clinical samples, the sensitivity of the three methods were higher than the nested PCR method. The coincidence rate between the-based real time PCR method and the nested PCR method was 95.24%, and which of the other two real time PCR methods and the nested PCR method were 98.41%. In comparison, the-based real time PCR has the highest sensitivity, and it is more suitable for the detection of samples with low content ofDNA.

; real time PCR; comparison of methods;insertion sequence

S852.6

A

1672-352X (2021)06-0947-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.022

2022-1-7 13:05:45

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20220106.1254.044.html

2021-01-13

国家自然科学基金（31602055）资助。

董 浩，博士，兽医师。E-mail：tunghao@163.com

通信作者:梁春南，副主任技师。E-mail：chunnan_liang@nifdc.org.cn