基于肿瘤数据库分析IGFBP5基因在结直肠癌中的表达及意义

张 聪 曹立宇

结直肠癌是消化系统恶性肿瘤之一，在我国恶性肿瘤致死率顺位排名中居于第三位，多数结直肠癌患者在确诊时已处于中晚期，5年生存率较低[1-2]。转移和复发是结直肠癌患者的主要致死因素[3]。

胰岛素样生长因子结合蛋白家族(Insulin-like growth factor-binding proteins)包括IGFBP1-7共7个成员，这7个成员在新陈代谢中起着至关重要的作用，例如，胰岛素抑制IGFBP1这是胰岛素分泌的一个标志[4]。IGFBP5是该家族一员，在细胞生长、分化、凋亡和细胞代谢中发挥重要作用。有研究证明IGFBP5浓度与肥胖男性脂联素浓度相关，提示IGFBP5可能参与代谢综合征[5]。此外，IGFBP5的缺失导致轻度葡萄糖耐受不良和加重饮食诱导的肥胖[6]。并且IGFBP5参与前列腺癌、胃癌等多种肿瘤的发生发展[7-8]。

本研究通过分析GEPIA和Linked Omics数据库，研究IGFBP5基因在结直肠癌中的表达水平与临床参数的关系，分析IGFBP5与结直肠癌生存和预后的影响，并进一步探讨IGFBP5参与结直肠癌发生发展的分子机制，以期对结直肠癌的初步诊断和临床治疗提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 病例资料

GEPIA2(gepia2.cancer-pku.cn)网站是1个分析肿瘤和正常样本的在线工具，其数据来源TCGA和GTEx数据库，它提供了可定制的功能，比如肿瘤/正常的微分表达式分析，可提供肿瘤患者肿瘤患者的临床参数分析和生存分析等[9]。LinkedOmics数据库包含来自TCGA数据库的32种癌症类型的多组学数据和临床数据，共有11158名患者。它也是第一个集成了基于质谱(MS)的全球蛋白质组学数据的多组学数据库，LinkedOmics主要有3个分析模块，Link Finder板块可以灵活地探索感兴趣的分子或临床属性与所有其他属性之间的关联，并可进行分析和和可视化；Link Compare板块可轻松比较LinkFinder识别出的关联，这在多组学和全癌分析中特别有用；Link Interpreter板块通过路径和网络分析将已识别的关联转换为生物学理解[10]。ONCOMINE包含65个基因表达数据集，包括超过4700个微阵列实验的接近4800万个基因表达测量值。可将大多数主要类型的癌症与各自的正常组织以及多种癌症亚型进行比较，基于临床和病理学的分析可用于探索，可以查询所有分析中选定基因或选定分析中多个基因的数据并可视化[11]。

1.2 IGFBP5表达分析

通过查阅ONCOMINE数据库研究IGFBP5在多种肿瘤中的表达水平，结果显示：IGFBP5基因在脑与中枢神经肿瘤、白血病、胰腺癌、肺癌和结直肠癌等多种肿瘤中表达水平上调。

使用RT-qPCR实验验证IGFBP5基因在结直肠癌中的表达。首先使用NCBI网站设计IGFBP5引物，上游序列：5'--3' ACCTGAGATGAGACAGGAGTC和下游序列5'--3' GTAGAATCCTTTGCGGTCACAA，设计内参GAPDH引物，上游序列5'--3' GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT和下游序列5'--3' GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG，退火温度为60 ℃，按照TAKARA公司试剂盒进行实验。38例结直肠癌组织及其配对组织来源于2014至2019年间在安徽医科大学附属阜阳医院病理科做冰冻切片的剩余组织，所有病例均经病理诊断，并经患者及家属知情同意。

1.3 临床参数分析

使用LinkedOmics数据库分析IGFBP5与结直肠癌临床病理参数的相关性。本研究应用LinkFinder模块分析IGFBP5的基因表达水平与结直肠癌的临床病理特征的关系。操作步骤为：①肿瘤类型：选择结直肠癌；②数据类型选择RNAseq；③数据属性：选择IGFBP5；④靶数据类型：选择Clinical；⑤统计学方法：选择非参数检验。

1.4 生存分析

使用GEPIA2数据库分析IGFBP5表达与结直肠癌患者总生存期和无病生存期之间的关系。操作步骤为：①输入基因名IGFBP5；②点击生存分析页面，选择总生存期/无病生存期；③选择肿瘤类型结直肠癌(同时选取COAD和READ)；④点击plot可视化分析，GEPIA使用Log-rank检验，即Mantel-Cox检验，用于假设检验，cox比例危险比和95%置信区间信息也可以包含在生存图中。

1.5 基因集富集分析

使用LinkedOmics数据库分析IGFBP5与结直肠癌临床病理参数的相关性。本研究应用Link Interpreter板块基于IGFBP5基因在结直肠癌中的表达水平进行GO和KEGG聚类分析。操作步骤为①肿瘤类型：选择结直肠癌；②数据类型选择RNAseq；③数据属性：选择IGFBP5；④靶数据类型：选择RNAseq；⑤统计学方法：选择Spearman相关性分析；⑥导出数据：导出结直肠癌中与IGFBP5表达显著相关的前1000位基因；⑦分析：使用DAVID网站进行GO和KEGG聚类分析。

1.6 IGFBP5相关基因靶点网络和蛋白互作网络图

应用Cytoscape 3.6.1软件构建IGFBP5相关基因靶点网络，同时使用STRING数据库检索IGFBP5共表达蛋白，并构建IGFBP5分子调控网络，将二者结果取交集，得出与IGFBP5基因关联最紧密的基因。

1.7 统计学方法

应用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析。应用配对t检验分析IGFBP5在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达水平，使用χ2检验分析IGFBP5与结直肠癌临床病理参数之间的相关性，使用Log-rank检验法分析IGFBP5表达与结直肠癌患者生存之间的相关性，基因富集分析结果中认为P<0.05且FDR(false discovery rates)<0.25的基因集为显著富集基因集。所有数据以P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IGFBP5在结直肠癌组织中表达水平升高

通过查阅ONCOMINE数据库，发现IGFBP5基因在中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌和淋巴瘤中表达水平升高(P<0.05)。采用RT-qPCR实验检测IGFBP5在38例结直肠癌组织及其配对组织中的表达，得到了一致的结果(P<0.05)(图1)。

2.2 IGFBP5在结直肠癌中的表达水平与其临床病理参数的相关性

选择LinkedOmics数据库分析IGFBP5在结直肠癌中与其临床病理参数的相关性，结果显示：IGFBP5与结直肠癌N分期(n=373)显著相关(P=0.025)，而与肿瘤分级(n=358)、T分期(n=375)和M分期(n=306)均无显著相关性(P>0.05)(图2)。

2.3 IGFBP5表达与结直肠癌患者预后的相关性分析

本研究应用GEPIA2数据库进行生存分析，结果显示在结直肠癌中，IGFBP5高表达组(n=135)总生存期较IGFBP5低表达组(n=135)明显降低(P=0.014)，其中HR=1.8，P(HR)=0.016；结直肠癌中IGFBP5高表达组(n=135)无病生存期较IGFBP5低表达组(n=135)明显降低(P=0.0082)，其中HR=1.9，P(HR)=0.0095(图3)。

2.4 IGFBP5的功能基因集富集

在Linkedomics数据库导出结直肠癌中与IGFBP5相关的前1000位相关基因，采用DAVID网站分析IGFBP5的分子功能和相关信号通路，GO分析结果显示：IGFBP5在结直肠癌中与细胞黏附、血管生成和血管内皮生长因子等多种促癌功能有关，KEGG分析结果显示：IGFBP5基因与PI3K-Akt信号通路激活有关(表1)。

2.5 IGFBP5共表达基因分析

为获得与富集所得生物学功能和相关信号通路相关的潜在上下游分子，我们使用Cytoscape 3.6.1软件构建IGFBP5相关基因靶点网络，同时使用STRING数据库检索IGFBP5共表达蛋白，并构建IGFBP5分子调控网络，将二者结果取交集，结果显示在IGFBP5共表达基因中，IGF1、IGF2、SPP1、LTBP1和FAM20C基因与IGFBP5基因关联最紧密。

图3 IGFBP5表达与结直肠癌患者总生存期(左)和无病生存期(右)的相关性分析

3 讨论

胰岛素样生长因子5(IGFBP5)位于人类染色体2q35上，编码含272个氨基酸残基的多通道跨膜蛋白，分子量30.5 kDa，是体内生长激素的1个重要调节因子[12]。有关IGFBP5的生物学功能研究较少，有研究证明IGFBP5浓度与肥胖男性脂联素浓度相关，提示IGFBP5可能参与代谢综合征[5]。此外，IGFBP5的缺失导致轻度葡萄糖耐受不良和加重饮食诱导的肥胖[6]。并且IGFBP5参与前列腺癌、胃癌等多种肿瘤的发生发展[7-8]。

近年来IGFBP5在肿瘤中的研究逐渐展开，Neuzillet等[13]研究发现，IGFBP5在膀胱癌中通过抑制IGF1R信号通路促进肿瘤细胞增殖能力和迁移能力，进而促进了膀胱癌的发生发展。Sun等[14]研究发现circPIP5K1A通过靶向miR-661/IGFBP5轴促进卵巢癌进展，支持其作为该疾病治疗的候选靶点的实用性。启动子甲基化可引起该基因的沉默，IGFBP5基因启动子区甲基化水平在胃癌中明显高于癌旁组织，进一步证实IGFBP5可作为胃癌的表观遗传学标记物[15]。然而也有研究者发现，在黑色素瘤中，IGFBP5表现相反，抑制肿瘤细胞的生长和迁移[16]。因此，在不同的肿瘤中，由于肿瘤之间发生机制的差异性，IGFBP5可能有着不同的作用。本研究结果显示相对于正常癌旁组织，IGFBP5在结直肠癌组织中表达水平显著性，进一步分析发现IGFBP5与结直肠癌N分期呈显著性正相关，而与T分期、M分期和肿瘤分级并无显著相关性，即IGFBP5表达水平越高的结直肠癌患者肿瘤的淋巴结转移水平越高，提示IGFBP5的表达促进结直肠癌细胞的转移，可能是结直肠癌的促癌因子。生存分析也证实了IGFBP5是结直肠癌的不良预后因素，IGFBP5表达水平与结直肠癌总生存期和无病生存期具有显著负相关性。因此IGFBP5的表达可能促进结直肠癌的发生发展。肿瘤的发生发展影响因素及其复杂，在正常结直肠癌恶变的过程中，多伴有细胞的黏附水平降低以及血管生成水平的变化[17-18]，而PI3K-Akt信号通路抑制肿瘤细胞的凋亡以及促进增殖有关，是肿瘤发生发展过程中一个重要的信号通路[19-20]。本研究通过GO分析，发现IGFBP5的表达可促进细胞黏附、血管生成和血管内皮生长因子等多种促癌功能，提示IGFBP5可能对结直肠癌上皮细胞的恶变具有促进作用，KEGG分析结果显示IGFBP5表达与PI3K-Akt信号通路激活有关，参与肿瘤发生发展的调控。通过分子互作网络分析，我们筛选出了IGF1、IGF2、SPP1、LTBP1和FAM20C等IGFBP5共表达基因，其中IGFI、IGF2是IGFBP5的重要调控因子[21]，而SPP1是PI3K-Akt信号通路上游调控因子[22]。由此可以推测IGFBP5很可能是同坐作用于SPP1，间接激活PI3K-Akt信号通路，从而促进结直肠癌的发生和发展。

表1 基因富集结果

本研究的创新之处在于利用网络数据库中具有完整临床资料的病例，样本量大，结合基础实验验证可信度高，然而不足之处也很明显，无论是GEPIA2还是LinkedOmics数据库提供的都是IGFBP5基因mRNA水平的表达数据，无法检测IGFBP5在结直肠癌中的蛋白表达水平。本研究为以后IGFBP5在肿瘤中的临床研究提供了理论基础，明确IGFBP5在结直肠癌乃至整个肿瘤中所起的作用和具体分子机制尚需要进一步的实验，展开更深入的研究，从而为肿瘤的早期诊断、临床治疗和预后知道提供靶向新思路。