丝裂霉素抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路对前列腺癌小鼠原位细胞移植模型的作用与机制研究

2021-03-22常俊锴侯俊清朱朝阳李晓东李铁强徐卫波赵小磊赵振华

实用癌症杂志 2021年3期

常俊锴侯俊清朱朝阳李晓东李铁强徐卫波赵小磊赵振华刘辉

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内尤其是欧美地区为高发区[1]。目前临床上对于前列腺癌主要采用内分泌治疗，但是长期治疗中随着前列腺癌细胞向着雄激素非依赖性前列腺癌细胞的转变，会使得常规内分泌治疗失效[2]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作为1种丝氨酸/苏氨酸激酶，其参与了多条信号通路传导，mTOR可磷酸化真核细胞起始因子,进而调控细胞增殖和细胞凋亡[3]。PI3K-AKT-mTOR信号通路在前列腺癌细胞中的异常活化有助于增加肿瘤细胞的耐药性，促进肿瘤细胞的存活[4-5]。临床前研究结果显示，明确靶向PI3K-AKT-mTOR信号通路的抑制剂在多种肿瘤中具有明确的药理学效应[6]。因此选择性抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路可作为1种新型的治疗前列腺癌的方案。

本研究中我们在小鼠前列腺原位种植前列腺癌细胞株RM-1,人工制备前列腺癌小鼠原位细胞移植模型，该模型能够较好的模拟人转移性前列腺癌，可用于抗癌药物的筛选。选择PI3K-AKT-mTOR信号通路及其临床常用抗生素类化疗药物丝裂霉素作为治疗药物。研究丝裂霉素在治疗RM-1原位移植小鼠前列腺癌肿瘤模型中的作用与机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

自ATCC购买小鼠前列腺癌细胞株RM-1，生长于10%GIBCO胎牛血清RPMI1640完全培养基中，在5%CO2、37 ℃条件下培养，每3天传代一次。使用0.25%的胰蛋白酶消化传代细胞，选取状态好且处于对数生长期的细胞，消化后1 500 rpm离心收集细胞沉淀，用PBS重悬细胞，反复3次，最后一次重悬细胞后细胞计数，稀释配置成1.0×108个/ml细胞悬液，使用台盼蓝染色在显微镜下检测活细胞比率大于95%。

1.2 动物分组

于扬州大学比较医学中心购买50只10周龄的C57BL/6雄性小鼠，实验动物合格证号：SCXK(苏)2007-0001。体重24～26 g，饲养于SPF级鼠房，小鼠可自由摄取食物和无菌饮用水，待小鼠适应环境之后，随机分为对照组、假手术组、模型组和丝裂霉素高低给药组，每组10只小鼠。

1.3 动物造模

所有小鼠在造模前按3.5 μl/g体重10%水合氯醛麻醉小鼠，将小鼠腹部朝上固定于无菌手术台上，切开下腹部显露出腹腔，在10倍显微镜下进行精细操作，找到小鼠膀胱和生殖腺之后向两侧推开，暴露前列腺，除对照组和假手术组外所有小鼠用微量注射器分别向两侧前列腺侧叶注射RM-1细胞悬液10 μl，观察到包膜鼓起并脱离腺体为注射成功标志，假手术组小鼠在前列腺同一位置注入等体积的PBS溶液，对照组小鼠只进行开腹手术，恢复所有移动脏器的位置后缝合小鼠腹部切口，待小鼠苏醒后给予正常饲料和无菌饮水。本研究采用治疗给药方式，原位造模后第二天开始高低给药组分别按0.2 ml/20 g体重腹腔注射1、2 mg/kg的丝裂霉素PBS溶液，对照组、假手术组和模型组分别腹腔注射相同体积的PBS，每周给药两次。每天定时记录小鼠体重变化和小鼠状态，连续治疗14天。小鼠出现蜷缩，体温下降等濒死状态时经眼眶取血后脱颈处死小鼠，记录为时间和体重，取小鼠各个脏器及前列腺组织。取前列腺原位癌组织，量取癌组织体积，取各脏器检测前列腺癌转移情况。

1.4 检测指标

记录所有组别小鼠在前列腺癌细胞原位移植造模前和造模治疗期间体重变化趋势，制作体重变化率曲线。同时记录每组每只小鼠活动状态，根据小鼠疾病活动指数标准评价每组小鼠活动状态。

记录所有小鼠死亡时间，制作所有组小鼠死亡率曲线。

测定每组中所有小鼠原位前列腺癌组织大小，绘制瘤体积散点图。

使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中前列腺癌特异性抗原。鉴定原位移植模型中前列腺癌转移状态，及药物干预对前列腺癌的转移率的影响作用。

提取小鼠前列腺组织RNA，使用q-PCR法检测PI3K-AKT-mTOR信号通路关键蛋白基因表达水平，检测不同组别小鼠前列腺组织及其前列腺癌组织中基因差异性表达。

使用western blot法检测PI3K-AKT-mTOR信号通路中关键调控蛋白的表达水平，研究PI3K-AKT-mTOR信号通路在前列腺癌细胞小鼠原位移植模型中的作用及其给药干预后PI3K-AKT-mTOR信号通路在治疗中的角色。

1.5 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计处理。实验数据用平均值±标准差表示，多个样本均数间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 小鼠体重变化率

除对照组小鼠之外，所有小鼠经历了麻醉后开腹腔和前列腺原位注射手术，在术后两天内小鼠体重均有所下降，从第三天开始假手术组小鼠体重开始显著回升，两个给药组小鼠体重下降率略低于模型组小鼠，在造模后期模型组体重下降最多，其次是低剂量和高剂量给药组，假手术组小鼠体重接近于对照组小鼠。

2.2 丝裂霉素治疗对前列腺癌小鼠疾病活动指数(DAI)评分的影响

从结果来看：模型组小鼠DAI评分高达(5.4±0.72)，显著高于对照组(0.15±0.13)和假手术组(0.3±0.21)(P<0.05),丝裂霉素干预治疗组小鼠DAI指数显著下降，与模型组相比差异显著(P<0.05)。这说明丝裂霉素能够改善荷瘤小鼠生存状态和活动状态，见表1。

表1 丝裂霉素治疗对前列腺癌小鼠DAI评分的影响

2.3 小鼠死亡率比较

在小鼠原位前列腺癌细胞移植模型中，在无菌操作台及SPF饲养条件下小鼠没有出现感染死亡案例，在手术操作及小鼠麻醉过程中低剂量组出现了1例死亡，统计所有小鼠在原位注射麻醉苏醒后小鼠自然死亡案例，其中对照组和假手术组没有小鼠死亡，原位注射的模型组在不同时间段出现了5只死亡，实验结束时死亡率为50%，低剂量组出现了4只死亡，死亡率为40%，高剂量出现了3只死亡，死亡率为30%，同时丝裂霉素治疗组小鼠死亡多发生在造模中后期，且死亡率较模型组具有较大的差异。具体结果如下图1所示。

图1 每组小鼠死亡率结果曲线

2.4 小鼠前列腺肿瘤体积散点图

此次小鼠前列腺原位肿瘤移植模型中，模型组小鼠肿瘤体积显著增加，丝裂霉素治疗组小鼠原位肿瘤体积显著小于模型组(P<0.05)，说明丝裂霉素能够有效的抑制小鼠原位肿瘤生长，减轻小鼠的肿瘤负荷。具体结果见图2所示。

图2 小鼠前列腺肿瘤体积散点图

2.5 小鼠血清前列腺癌特异性抗原检测

检测结果显示：模型组小鼠血清中前列腺癌特异性抗原浓度远大于对照组，具有显著性差异(P<0.05)，两个丝裂霉素给药组小鼠血清前列腺癌特异性抗原含量较模型组显著下降(P<0.05)，但仍高于对照组小鼠。具体见下表2。

表2 每组小鼠前列腺癌特异性抗原浓度

2.6 PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白基因表达情况(表3)

与对照组相比，模型组小鼠前列腺原位肿瘤中PI3K、AKT和mTOR基因的mRNA水平显著上调(P<0.05)，给药治疗基因表达水平较模型组显著下调(P<0.05)，但仍没有达到对照组水平。

表3 PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白基因表达水平

2.7 小鼠前列腺原位移植瘤中PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白检测

western bloting检测结果见图3，结果显示，模型组中AKT和mTOR总蛋白水平较对照组显著下降(P<0.05)，同时模型组中p-AKT和p-mTOR水平显著上升(P<0.05)，说明在小鼠原位前列腺癌模型中PI3K-AKT-mTOR信号通路处于激活状态，给药治疗后AKT和mTOR总蛋白水平较模型组显著上升(P<0.05)，同时给药组中p-AKT和p-mTOR水平显著降低(P<0.05)，说明丝裂霉素治疗后能够有效的抑制原位前列腺癌移植模型中PI3K-AKT-mTOR信号通路的过度激活。量化western blotting结果见图4。

图3 小鼠前列腺原位移植瘤中PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白表达水平

3 讨论

前列腺癌在欧美国家的发病率和死亡率均处于常见恶性肿瘤前列，在我国随着生活方式的改变，前列腺癌在近些年逐渐成为泌尿系统最主要的疾病。在前列腺癌发生发展中雄性激素具有重要的作用，前列腺癌前期治疗中阻断雄性激素作用明显，但是在治疗后期极易复发，转变为雄性激素非依赖性前列腺癌，增加治疗的难度[7]。同时前列腺癌在明确诊断时患者往往已经发生了全身性转移，前列腺肿瘤的原位诊断和转移肿瘤的异质性均在很大程度上增加了患者的死亡率[8]。

P13K-Akt-mTOR信号通路参与细胞周期进程、通过AKT可调控细胞凋亡相关蛋白，从而抑制细胞凋亡，在前列腺癌中抑癌基因PTEN的失活能够促进血管生成相关基因的过度表达，增加肿瘤组织的血管形成.由此可见过度激活的P13K-Akt-mTOR信号通路在前列腺癌的发生发展中具有重要的作用[9-11]。丝裂霉素作为一种细胞周期非特异性药物，其能够有效的抑制DNA复制，进而阻滞细胞周期和细胞增殖[12]。丝裂霉素目前主要在临床上用于治疗消化道肿瘤或者和化疗药物联合治疗转移性肺癌和胃癌。本研究中采用前列腺原位注射小鼠前列腺癌细胞株RM-1，构建小鼠前列腺移植肿瘤模型，选择临床化疗药物丝裂霉素作为研究药物，原位注射模型小鼠随着肿瘤细胞种植时间的推移，出现明显体重下降，至造模结束，小鼠体重仅为初始体重的68%，同时化疗治疗组小鼠体重后期呈现下降减缓趋势，说明丝裂霉素能够有效的抑制前列腺癌细胞株原位注射造成的小鼠荷瘤负担。这与Thomas[13]的研究具有相似的结果。前列腺癌作为一种高发病率和致死率的男性常见恶性肿瘤，存活时间和存活率是评价治疗有效性的重要指标，正如我们研究结果所示：小鼠经原位注射前列腺癌细胞株后，在两周时间内模型组出现了50%的死亡率，这符合前列腺癌高致死的基本特征，而丝裂霉素干预治疗组小鼠死亡率明显下降，同时小鼠的疾病活动指数也显著下降，这提示我们丝裂霉素能够显著改善荷瘤小鼠的生存状况，有助于降低小鼠死亡率。丝裂霉素作为一种临床常用化疗药物，其抑制细胞周期的作用已被广泛证明。本研究中丝裂霉素干预治疗能够有效的抑制肿瘤体积，减轻小鼠荷瘤负担。前列腺癌是一种难确诊易转移的恶性肿瘤，很多死亡患者均伴有不同程度的肿瘤转移，本研究中我们检测了前列腺癌血清转移指标前列腺癌特异性抗原，我们发现在模型组中小鼠血清中含有高浓度的前列腺癌特异性抗原，这提示在原位注射模型中小鼠体内前列腺癌发生了明显的转移，而干预治疗组前列腺癌特异性抗原浓度显著下降，说明丝裂霉素能够有效的抑制原位前列腺癌的全身性转移。综上结果可知，丝裂霉素能够改善小鼠的荷瘤生存状况，这很有可能是基于丝裂霉素能够抑制原位前列腺癌细胞的增殖，显著的阻滞前列腺癌的全身性转移。基于此，我们研究了与细胞周期、细胞凋亡和肿瘤血管生成相关的P13K-Akt-mTOR信号通路，已有研究表明P13K-Akt-mTOR信号通路在前列腺癌中是出于显著激活状态，能够促进肿瘤增殖和肿瘤组织血管生成。我们检测了小鼠前列腺及其前列腺癌组织P13K、Akt和mTOR蛋白的基因表达水平，我们发现其基因表达水平显著上调，这与Mathews的[14]研究结果相似，我们也检测了相应的蛋白表达水平，同时量化分析了磷酸化蛋白的表达变化，其结果与基因表达相似，在原位前列腺癌模型中P13K-Akt-mTOR信号通路处于显著激活状态，丝裂霉素干预治疗能够有效的抑制P13K-Akt-mTOR信号通路的激活[15-17]，鉴于此我们认为丝裂霉素可能是通过调节P13K-Akt-mTOR信号通路进而影响前列腺癌的发生与发展。