APP下载

ADAMTS9基因启动子甲基化在直肠癌中的表达与临床病理特征的相关性

2021-03-22高永涛

实用癌症杂志 2021年3期
关键词:癌基因表观甲基化

刘 涛 白 浪 高永涛

直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤,在中国的发病率也呈逐年上升趋势,严重威胁人类健康[1-3]。多项研究证实直肠癌的发生发展与癌基因、抑癌基因突变有关[4]。抑癌基因甲基化是肿瘤发生发展的常见的表观遗传学变化,有研究证实抑癌基因启动子区CpG岛甲基化与直肠癌的发生发展有关[5]。ADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)是一种新型金属蛋白酶家族,参与多种生理学和病理学过程如血管生成、癌症发生等[6]。ADAMTS9是ADAMTS家族成员之一,作为抑癌基因抑制多种肿瘤发生发展[7]。本研究旨在探讨ADAMTS9基因甲基化在直肠癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 TRIzol(美国Invitrogen公司)、DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)、Taq酶(日本Takara公司)、CpGenome DNA修饰试剂盒(Chemicon公司)。

1.1.2 标本 在取得直肠癌患者或家属知情同意后,收集2016年1月至2018年12月间于延安大学附属医院普通外科医院行直肠癌根治手术切除的83例直肠癌组织及其相应的癌旁组织标本。所有患者直肠标本均经术后病理证实直肠腺癌,术前均未行新辅助放化疗,83例直肠癌手术中,57例行腹腔镜直肠癌根治术,26例行开腹直肠癌根治术。83例患者中,男性52例,女性31例,平均年龄(53.8±10.2)岁。

1.2 方法

1.2.1 提取直肠癌组织、癌旁组织中RNA、DNA 在液氮中将直肠癌和癌旁组织研磨至粉末状,加入1 ml的TRIzol试剂后依次提取细胞总RNA和基因组DNA。

1.2.2 ADAMTS9 mRNA表达水平检测 利用Real Time PCR检测ADAMTS9 mRNA表达水平,分别取上述直肠癌、癌旁组织总RNA 2 μg进行逆转录,采用Takara公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒,以β-actin为内参,测定ADAMTS9基因的mRNA水平。ADAMTS9上游引物:5'-GGATCGTGGCTACTGACCGCAA-3',下游引物:5'-GACGTTGACGCCGATTGCACTAA-3'。反应体系包括:SYBR Green I Master Mix 12 μl、10 μmol/l引物各1 μl、cDNA 2 μl,加去离子水补足体积至25 μl。反应条件:52 ℃ 1 min,95 ℃预变性3 min,40个循环,目的基因相对于内参基因的mRNA水平以2-ΔΔCt值表示。

1.2.3 ADAMTS9基因启动子甲基化分析 分别取上述直肠癌、癌旁组织总DNA,采用CpGenome修饰试剂盒进行亚硫酸氢钠修饰,利用巢式-甲基化特异性PCR(nest-methylation-specific PCR,MSP)进行ADAMTS9基因启动子区甲基化水平的检测。ADAMTS9上游引物:5'-AACGTTGACGTGACCGGTACGACT-3',下游引物:5'GGCATTGACTCAAGTCG-3',USP上游引物:5'-TTGCAACGGCATGACC-3',下游引物:5'-GGCATGACTTACGGTTACGCATC-3'。^MSP反应体系如下:总RNA 1 μl,PCR buffer 2.5 μl,引物各0.5 μl,加至总体积25 μl,反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 60 s,共 35个循环,72 ℃延伸10 min。取10 μl的PCR扩增产物进行3%琼脂糖凝胶电泳,ChemilmagerTM5500凝胶成像处理系统观察电泳结果。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 直肠癌、癌旁组织中ADAMTS9 mRNA表达水平

通过Real Time PCR 检测ADAMTS9基因在83例直肠癌组织和配对癌旁组织中的mRNA相对表达水平,结果显示直肠癌组织中ADAMTS9 mRNA相对表达水平为(23.6±8.59),低于配对癌旁组织的(35.2±9.18),差异有统计学意义(χ2=1161,P<0.0001),表明ADAMTS9基因可能在mRNA转录水平参与直肠癌的发生发展过程。见图1。

图1 直肠癌、癌旁组织中ADAMTS9 mRNA表达水平

2.2 直肠癌、癌旁组织中ADAMTS9基因启动子甲基化状态

应用MSP方法分析83对直肠癌组织和癌旁组织的ADAMTS9基因启动子区CpG岛的甲基化状态(图2),结果显示83例直肠癌组织中ADAMTS9基因启动子区CpG岛甲基化17例,甲基化发生率20.5%,83例癌旁组织中ADAMTS9基因启动子区CpG岛甲基化发生率7.2%(6/83),直肠癌组织与癌旁组织的ADAMTS9基因启动子区CpG岛的甲基化率有显著性差异(χ2=37.19,P<0.0001)。Logistic回归分析显示ADAMTS9基因启动子区CpG岛的异常甲基化可增加直肠癌发病风险(OR=10.254,95%CI=3.395~25.631)。

图2 ADAMTS9基因启动子区在直肠癌和癌旁组织中的甲基化电泳图谱

2.3 ADAMTS9基因启动子甲基化与直肠癌临床病理特征之间的相关性

通过分析直肠癌组织中ADAMTS9启动子区甲基化频率与直肠癌临床病理特征的相关性,结果表明直肠癌组织中ADAMTS9启动子区甲基化与肿瘤TNM分期、分化程度相关。T1、T2,高分化,Ⅰ、Ⅱ期直肠癌患者中ADAMTS9启动子区甲基化频率更低,而ADAMTS9启动子区甲基化与直肠癌患者年龄、性别、肿瘤大小无明显相关性,表明ADAMTS9启动子区甲基化与直肠癌发生发展有关。见表1。

表1 ADAMTS9启动子区甲基化与直肠癌临床病理特征之间的相关性(例,%)

3 讨论

直肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一,近年来其发病率和死亡率均呈逐年上升趋势,因此,研究直肠癌的发病机制具有很高的价值[8-9]。随着对直肠癌发病机制的研究不断深入,大量研究证实直肠癌的发生与遗传和环境长期作用密切相关,癌基因和抑癌基因的失衡是直肠癌发病的重要机制[10-11]。

越来越多的证据表明表观遗传异常也在直肠癌的发病中发挥作用。DNA甲基化(DNA methylation)是表观遗传学的重要现象,与基因组印记(genomic imprinting),基因沉默(gene silencing)等表观遗传现象参与肿瘤的发生发展[12-15]。基因组中DNA的甲基化模式是通过DNA甲基转移酶实现哺乳动物基因表达调控的重要形式,DNA甲基化异常引起抑癌基因失活和癌基因激活是直肠癌发生的重要机制之一,DNA异常甲基化的逆转可能有助于直肠癌的诊断和治疗[16-17]。人类 ADAMTS 家族包含 19 个分泌型的多域蛋白水解酶,ADAMTS 家族成员作为肿瘤抑制基因(tumor suppressor genes,TSGs)发挥作用,有研究报道 ADAMTS家族成员的表观遗传学修饰参与直肠癌发病机制[18]。有研究表明,ADAMTS9在食管癌组织中表达降低,且与ADAMTS9基因的启动子甲基化有关[19-20]。但研究ADAMTS9基因在直肠癌中的作用较少。本研究发现,直肠癌组织中ADAMTS9 mRNA表达水平低于配对癌旁组织(χ2=1161,P<0.0001),表明ADAMTS9基因可能在mRNA转录水平参与直肠癌的发生发展过程。通过应用MSP方法,进一步分析ADAMTS9基因启动子区CpG岛的甲基化状态,结果直肠癌组织中ADAMTS9基因启动子区CpG岛甲基化发生率为20.5%,高于癌旁组织甲基化发生率7.2%(χ2=37.19,P<0.0001)。Logistic回归分析显示ADAMTS9基因启动子区CpG岛的异常甲基化可增加直肠癌发病风险。分析直肠癌组织中ADAMTS9启动子区甲基化频率与直肠癌临床病理特征的相关性,结果表明直肠癌组织中ADAMTS9启动子区甲基化与肿瘤TNM分期、分化程度相关,进一步证实抑癌基因ADAMTS9启动子区甲基化不但参与了直肠癌的发生,而且与直肠癌的进展和转移有关。上述研究结果提示ADAMTS9启动子区甲基化可为直肠癌的早期诊断及预后判断提供帮助。然而,关于ADAMTS9启动子区甲基化如何进一步影响直肠癌发生发展的机制仍有待于进一步研究。

直肠癌的发生、发展是多个基因、多种因素综合作用的结果,随着对DNA甲基化和表观遗传学研究的深入,我们终将揭开直肠癌的发病机制。我们的研究初步证实了直肠癌组织中抑癌基因ADAMTS9启动子区异常甲基化与肿瘤发生发展密切相关,为后续直肠癌的表观遗传学研究提供了依据。

猜你喜欢

癌基因表观甲基化
甲基苯丙胺改变成瘾小鼠突触可塑性基因的甲基化修饰
绿盲蝽为害与赤霞珠葡萄防御互作中的表观响应
DNA甲基化与基因活性的调控
例析对高中表观遗传学的认识
癌基因敲除可完全抑制肺癌发生
抑癌基因WWOX在口腔肿瘤的研究进展
肝癌组织hSulf-1基因表达与其甲基化状态的关系
SOX30基因在结直肠癌中的表达与甲基化分析
促癌基因与抑癌基因
促癌基因与抑癌基因